Biyolüminesans Kullanarak Farede Bakteriyel Enfeksiyon Dinamiklerini İzleme

Patojenik bir bakterinin zayıflatılmış bir suşunun süspansiyonu ile başlayın.

Zayıflatılmış suş, virülans genlerinde hedeflenen delesyonlar nedeniyle azalmış patojenite gösterir.

Bakteriler, otonom ışık üretimini sağlayan biyolüminesans bir operon ile kromozomal olarak etiketlenmiştir.

Bakteriler, bir lusiferaz enzimi ve lusiferaz substratını sentezleyen bir enzim kompleksi üreterek biyolüminesans operonu eksprese eder.

Lusiferaz, görünür ışık üretmek için substratı oksitler.

Süspansiyonu santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Hücreleri bir tamponla yıkayın, tekrar santrifüjleyin ve kalan hücresel olmayan bileşenleri çıkarmak için süpernatanı atın.

Optimal bir bakteri konsantrasyonu elde etmek için hücreleri tamponda yeniden süspanse edin ve süspansiyonu bir şırıngaya çekin.

Süspansiyonu intraperitoneal olarak bir fareye enjekte edin, ardından bir kafese aktarın.

Biyolüminesans sinyalini düzenli aralıklarla görselleştirin.

Zayıflatılmış suş lokalize kalır ve biyolüminesans yavaş yavaş azalır, bu da enfeksiyonun temizlendiğini gösterir.

Enjeksiyonların sabahı, bakteri hücrelerinin dondurularak saklanan yumurtalarını üç ila dört saat boyunca dört santigrat derecede çözün. Çözdürdükten sonra şişeleri buz üzerinde tutun ve farelere iki saat içinde enjekte edin. Her bir kriyoviyalin içeriğini iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca 4.500 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve hücre peletini bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve PBS'deki hücreleri, mililitre başına dokuzuncu koloni oluşturan birimlere 2.5 çarpı 10'luk bir nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. Konsantrasyonu, genotipi ve fenotipi doğrulamak için her suşun son süspansiyonundan üç numune alın.

Her suş için, hücre süspansiyonunun 1.5 mililitresini iki mililitrelik bir tüpe ayırın ve PBS'yi kontrol enjeksiyonları için hazırlayın. Fareleri ve enjeksiyonlar için gerekli malzemeleri steril bir hayvan ameliyathanesinde toplayın ve başlamadan önce tüm yüzeyleri dezenfektan mendillerle silin. Isırıldığında delinme riskini sınırlamak için iki çift lateks eldivenin yanı sıra laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve yüz maskesi giyin.

Fareyi kafesten çıkarın ve tartın, enjeksiyon sonrası izleme için kuyruğu kalıcı işaretleyici ile işaretleyin. 27 gauge iğne ile yeni bir mililitrelik şırınga açın ve 200 mikrolitre steril PBS çekin. Başparmağını ve işaret parmağını kullanarak fareyi kulaklarının arkasından tutun ve ensede bir deri kıvrımı oluşturmak için sıkıştırın.

Ardından, fareyi düz ve hareketsiz tutmak için serçe parmağını kullanarak kuyruğu avuç içine sabitleyin. İğneyi orta hattın solundaki veya sağındaki periton boşluğuna 30 derecelik bir açıyla sokun. Organlara sokulmadığından emin olmak için iğneyi hafifçe kaldırın.

Ardından, PBS'yi yavaşça enjekte edin ve iğneyi geri çekin. Enjeksiyon bölgesinde bir bolus tipiktir. İğneyi belirlenen kesici alet imha kabına yerleştirin ve fareyi ayrı bir kafese taşıyın.

Prosedürü bir sonraki fare ile tekrarlayın ve bir kafesteki tüm fareler enjekte edildikten sonra onları orijinal kafeslerine geri taşıyın. Kontrol grubunu enjekte ettikten sonra, aynı prosedürü kullanarak test gruplarını enjekte edin. Tüm enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, fareleri muhafaza odasına geri koyun ve çalışma alanını dezenfektan mendillerle temizleyin.

Oksijen akışını dakikada 1,5 litreye ve izofluranı %3,5'e ayarlayın ve fareyi anestezi odasına, ardından anesteziyi takiben sıcaklık stabilize aşamaya getirin. Fareyi kolları uzatılmış olarak sırt üstü konumlandırın ve görüntüleme sırasında% 2.5 izofluran uygulaması için bir burun konisi takın.

Kapıyı kapatın ve farenin biyolüminesans görüntülerini ve röntgenlerini çekin. Görüntüleme tamamlandığında, fareyi kafesine geri koyun ve izleyin. Üç ila beş dakika içinde bilincini geri kazanmalıdır.