JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:27 dk. • September 26th, 2025
Bir antibiyotik seçim ortamında rekombinant Pseudomonas aeruginosa kültürü ile başlayın.
Bu bakteriler, silinmesi amaçlanan bakteriyel hedef genin yakınında genoma entegre edilmiş replikatif olmayan bir plazmit barındırır.
Entegrasyon, plazmit ve genom arasında paylaşılan homolog diziler yoluyla meydana geldi ve tek bir çaprazlama rekombinasyonu ile sonuçlandı.
Plazmit, bir antibiyotik direnç genini ve sükroz duyarlılığı sağlayan sacB genini kodlar.
Bakterileri sakaroz içeren ancak antibiyotik içermeyen bir ortama çizin ve inkübe edin.
Antibiyotik basıncı olmadan, homolog bölgeler arasında plazmit ve hedef geni eksize eden ikinci bir rekombinasyon veya çift çaprazlama meydana gelir.
Bakteri çoğalması sırasında, eksize edilen plazmit aktarılmaz ve bu da bakterileri sükroza toleranslı hale getirir.
Bakterileri seçici olmayan bir ortama ve sakaroz veya antibiyotik içeren bir ortama yamalayın ve inkübe edin.
Seçici olmayan ve sakaroz ortamında büyüme, ancak antibiyotik ortamında değil, başarılı bir çift çaprazlamayı doğrular.
Pseudomonas Isolation Broth veya PIB'de tek çaprazlama, rekombinant koloniler yetiştirerek başlayın. Her kültürün 10 mikrolitresini önceden ısıtılmış PIA plakalarına aşılayın ve çizin, %10 sakaroz ile desteklenmiştir. Ardından plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, plakaları inkübatörden çıkarın ve büyüme açısından inceleyin. Sükroza dirençli koloni, çift çaprazlama rekombinantları olmalıdır. En az 20 koloniyi önceden ısıtılmış PIA, %10 sükroz ile desteklenmiş PIA ve karbenisilin ile desteklenmiş PIA plakalarına yamamak için steril kürdan kullanın.
Plakaları gece boyunca inkübe edin ve ertesi gün büyüme açısından inceleyin. Gerçek çift çapraz rekombinantlar, karbenisiline duyarlı ve sakaroza dirençli olacaktır.