JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 5:46 dk • September 26th, 2025
Hif oluşturan bir bakteri olan Streptomyces venezuelae sporlarını içeren bir kuyuya sahip mikroakışkan bir plaka alın.
Belirlenen diğer kuyular ya besin açısından zengin ya da kullanılmış ortam içerir.
Sporlar, sırasıyla hif uçlarda ve çapraz duvarlarda lokalize olan floresan DivIVA ve FtsZ proteinlerini eksprese eden bir suştan türetilir.
Ters çevrilmiş bir mikroskobun objektif merceğine ve plakanın görüntüleme penceresine daldırma yağı uygulayın.
Plakayı mikroskop tablasına monte edin ve hızlandırılmış görüntülemeye başlayın.
Sporları plakanın kültür odasına yükleyin.
Daha sonra spor çimlenmesini başlatmak için besin açısından zengin ortamı ekleyin.
Hifler büyüdükçe, DivIVA hif uçlarında birikirken, FtsZ çapraz duvarlarda dağınık halkalar oluşturur.
Ardından, harcanan ortama geçin. Bu ortamdaki besin eksikliği sporülasyonu destekler.
Filizlenen hiflerde, DivIVA odakları kaybolur ve FtsZ, sporülasyon septaları oluşturarak düzenli bir bölünme halkaları merdiveni halinde yeniden düzenlenir.
Zamanla, aynı hiflerde FtsZ floresansının kaybolması, sporülasyonun tamamlandığını doğrular.
Çevre odasını önceden 30 santigrat dereceye ısıtın.
Ardından mikroskobu ve mikroskop kontrol yazılımını açın. Yüksek sayısal açıklıklı bir yağa daldırma hedefini yerine koyun ve sarı floresan ve kırmızı floresan protein füzyonlarının görüntüleri ile birlikte diferansiyel girişim kontrast görüntüleri elde etmek için ayarlanmış uygun filtrelerin ve diyagramatik aynaların yerinde olduğunu onaylayın. Objektife ve mikroakışkan plaka üzerindeki görüntüleme penceresinin altına da bir damla daldırma yağı damlatın.
Kapalı mikroakışkan cihazı ters çevrilmiş mikroskobun tablasına dikkatlice monte edin ve yerine sabitleyin. Mikroakışkan kültür odasının görüntüleme penceresini odak noktasına getirmek için gömülü konum işaretleyicilerini kullanın. A etiketli ilk akış odasının en sol kısmına odaklanın ve ardından sahneyi 0,7 mikrometrelik tuzak yüksekliğine karşılık gelen beşinci tuzak boyutuna getirin.
Mikroakışkan yazılımda, sistemi 15 saniye boyunca dört psi'de sekiz giriş kuyusundan hücreleri yükleyecek şekilde ayarlayın. İşlem çalıştırıldıktan sonra, sahneyi görüntüleme penceresi boyunca hareket ettirerek kültür odasındaki hücre yoğunluğunu kontrol edin. Hiçbir spor yakalanmamışsa, hücre yükleme adımını tekrarlayın veya alternatif olarak, görüntüleme penceresi başına bir ila 10 sporluk istenen hücre yoğunluğu elde edilene kadar yükleme basıncını ve/veya süresini artırın.
Kültür odasını aşırı yüklememeye dikkat edin. Ardından, kontrol yazılımında önceden hazırlanmış akış programını başlatın ve görüntü almaya başlamadan önce mikroakışkan plakanın mikroskop aşamasında bir saat boyunca ısı dengesine izin verin. Mikroskop kontrol yazılımında, önce görüntü dosyalarının otomatik olarak kaydedilmesi için bir dizin belirleyerek, zaman içinde birden çok aşama konumunda birden çok görüntü almak için çok boyutlu bir alım ayarlayın.
Daha sonra aydınlatma ayarlarına gidin ve her bir yapı için önceden belirlenmiş optimum aydınlatma ayarlarını girin. Ardından, 24 saat boyunca her 40 dakikada bir görüntü almak için bir zaman serisi ayarlayın. Sahne konumlarını belirlemek ve otomatik netlemeyi ayarlamak için, ilgilenilen her görüntüleme konumu için kültür odasını tarayın ve sahne konumlarını saklayın.
Tek aşamalı konumların, foto ağartmayı ve foto toksisiteyi en aza indirecek kadar uzağa yerleştirildiğinden emin olun. Seçilen sahne konumlarının Z koordinatları doğrulandıktan sonra, donanım otomatik odaklamasını etkinleştirin. Ardından mikroskop kontrol yazılımında hızlandırılmış deneyi başlatın.
24 ila 30 saat sonra veya ilgilenilen bölgedeki hifler sporlara farklılaştığında görüntü alımını durdurun. Ardından yazılımdaki akış programını durdurun ve mikroakışkan cihazı sökün. Kullanılmış mikroakışkan plakayı, giriş kuyularından, atık kuyusundan ve hücre yükleme kuyusundan kalan ortamı çıkararak kısa süreli depolama için hazırlayın.
Ardından A şeridinin kullanılmış kuyularını ve kullanılmayan şeritlerin kuyularını steril PBS ile doldurun. Son olarak, kurumasını önlemek için plakayı armut filmiyle kapatın. Ve tabağı dört santigrat derecede saklayın.