Bitki Hücrelerinde Bakteriyel Enfeksiyon ve Efektör Protein Dağıtımının İzlenmesi

Süper klasör yeşil floresan proteini veya sfGFP'nin floresan olmayan büyük parçalarını eksprese eden genetiği değiştirilmiş yaprak bölgelerine sahip deneysel bir bitki ile başlayın.

Bu modifiye edilmiş alanlara, sfGFP'nin küçük floresan olmayan fragmanı ile etiketlenmiş efektör proteinler içeren Pseudomonas bakterileri enjekte edin.

Bakteriler ve yaprak hücreleri arasındaki etkileşime izin vermek için inkübe edin.

Pseudomonas, özel bir salgı sistemi kullanarak, etiketli efektör proteinleri yaprağın sitozolüne iletir.

Büyük ve küçük GFP fragmanları arasındaki yakınlık, bunların fonksiyonel floresan sfGFP'ye birleştirilmesini sağlar ve bu daha sonra plazma zarına yer değiştirir.

İnkübasyondan sonra, enjekte edilen bölgelerden yaprak diskleri çıkarın.

Bu diskleri bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak görselleştirin.

Başlangıçta, otofloresansı en aza indirmek için yaprak diski düşük lazer yoğunluğunda görüntüleyin. Ardından görünürlüğü artırmak için lazer gücünü artırın.

Yeşil floresan, başarılı bakteriyel enfeksiyonu ve bitki hücrelerine efektör protein iletimini doğrular.

Nicotiana benthamiana yaprakları için, Pseudomonas süspansiyonunu, Agrobacterium'un iki gün önce sızdığı aynı alana sızdırın.

Son olarak, Pseudomonas ile aşılanmış yapraklardan bir yaprak diski kesin. Pseudomonas'ın sızmasından sonraki belirli zaman noktalarında, tek bir bitkiden iki, iki santimetre karelik yaprak diskini görüntülemek için konfokal bir lazer tarama sistemi kullanın. Ölü hücrelerin yaralanma nedeniyle ölmesini önlemek için hücreleri sızma deliğinden uzakta gözlemleyin.

Bakterilerden yer değiştiren efektörler sadece çok küçük miktarlarda bulunur. Bu nedenle, bir floresan sinyalini algılamak için lazer gücünü artırabilir ve bir floresan emisyonu elde edebilirsiniz. Bununla birlikte, bitki hücrelerinden otofloresanstan yanlış sinyal yakalamaktan kaçınmak için aşırıya kaçmayın.