Bakteri Suşları Arasındaki Rekabetçi Etkileşimleri İncelemek için Coincubation Testi

Her biri suş tanımlaması için farklı bir floresan işaretleyici ifade eden iki bakteri suşu, bir referans ve bir rakip ile başlayın.

Suşları eşit oranlarda karıştırın ve karışımı bir agar plakasına yerleştirin.

Suşların büyümesine ve etkileşime girmesine izin vermek için plakayı inkübe edin.

Rakip, temasa bağlı veya temastan bağımsız mekanizmalar yoluyla referans gerinimi geride bırakır.

Temasa bağlı rekabette rakip, toksinleri doğrudan referans suşa iletmek için özel salgı sistemleri kullanır.

Temastan bağımsız rekabette, yarışmacı, çevreleyen ortama yayılan ve referans suşa giren toksinleri serbest bırakır.

Bu toksinler, hücre duvarı sentezi, DNA replikasyonu ve protein sentezi dahil olmak üzere referans suştaki temel süreçleri bozarak büyümenin durmasına, hücre ölümüne ve floresan ekspresyonunun azalmasına yol açar.

İnkübasyondan sonra plakayı floresan mikroskobu altında inceleyin.

Rakibin daha parlak floresansına kıyasla referans suştaki azaltılmış floresan, rekabetçi etkileşimleri gösterir.

Referans suşu ve rakip suşu bire bir oranında karıştırmak için, OD 1.0'a normalize edilmiş her suştan 100 mikrolitreyi etiketli bir 1.5 mililitrelik santrifüj tüpüne ekleyin ve bir ila iki saniye vorteks yapın. Bir kontrol olarak, referans suşu kendisinin ve girdabın diferansiyel olarak etiketlenmiş bir versiyonuyla karıştırın.

Deneyin sonucunu önemli ölçüde değiştirebileceğinden doğru başlangıç oranını elde etmek çok önemlidir. Başarıyı sağlamak için bu adım, belirli bir bakteri türü için optimizasyon gerektirebilir. Her biyolojik kopya için bu adımı tekrarladıktan sonra, kontrol olarak farklı şekilde etiketlenmiş referans suşlara sahip dört biyolojik kopya ve farklı şekilde etiketlenmiş referans ve rakip suşlara sahip dört biyolojik kopya olmalıdır.

İnkübasyondan sonra floresan mikroskobu için kullanılacak kültür lekeleri yapmak için, LBS agar içeren bir Petri plakasına her kontrol ve deney karışımından 10 mikrolitre ekleyin. Lekeler tezgahta tamamen kuruduktan sonra plakaları 24 saat boyunca 24 santigrat derecede inkübe edin.