Mikroenjeksiyon Kullanılarak Zebra Balığı Larvasının Bağırsak Lümenine Bakterilerin Lokalize Verilmesi

Anestezi uygulanmış zebra balığı larvası içeren bir tabak alın.

Larvanın üzerine bir damla düşük erime noktalı agaroz uygulayın ve enjeksiyon sırasında bağırsak erişimine izin vermek için hafifçe yanal olarak konumlandırın.

Şimdi, agarozu katılaştırmak için kısaca soğutun, böylece larvayı hareketsiz hale getirin.

Larvayı anestezi altında tutmak için anestezik madde içeren ortam ekleyin.

Daha sonra, patojenik bir bakteri olan floresan etiketli Clostridioides difficile süspansiyonunu alın ve enjeksiyonun izlenmesini kolaylaştırmak için bir izleyici boya ekleyin.

Bu karışımı bir mikroenjeksiyon iğnesine yükleyin ve iğneyi bir mikromanipülatöre monte edin.

Stereomikroskop altında, iğneyi larva bağırsağına doğru yönlendirilmiş bir açıyla konumlandırın.

Ardından, iğne ucunu yavaşça bağırsak lümenine sokun.

Bakterileri doğrudan lümene enjekte edin ve izleyici boyayı kullanarak başarılı teslimatı onaylayın. Ardından iğneyi geri çekin.

Floresan mikroskobu kullanarak, Clostridioides difficile'nin larva bağırsağında lokalizasyonunu doğrulayın.

İlk olarak, üzerini örtmek için bir Petri kabındaki zebra balığı larvalarının üzerine bir damla %0,8 düşük erime noktalı agaroz koyun. Larvaları yavaşça yanal konuma ayarlayın. Düşük erime noktalı agarozun katılaşmasını sağlamak için Petri kabını 30 ila 60 saniye buz üzerine yerleştirin.

Agarozu kaplamak için %0,02 ila %0,04 trikain içeren %30 Danieau ortamı ekleyin. Enjeksiyon çözeltisi hazırlamak için, boya lekeli Clostridioides difficile inoculum'un dokuz mikrolitresine PBS çözeltisinde bir mikrolitre %0.5 fenol kırmızısı ekleyin. Kalibre edilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesini bir Mikroyükleyici kullanarak enjeksiyon solüsyonuyla yükleyin.

Yüklenen iğneyi bir mikromanipülatöre monte edin ve stereo mikroskop altına yerleştirin. Enjeksiyon basıncını 600 ila 900 hektopaskal arasında ayarlayın. 0,5 ila 1,0 nanolitre elde etmek için enjeksiyon süresini 0,1 ila 0,3 saniyeye ayarlayın.

İğneyi mikromanipülatörde, gömülü larvalara doğru bakacak şekilde yaklaşık 45 derecelik bir açıyla ayarlayın. İğne ucunu gastrointestinal sistemin üzerine, ürogenital gözeneğe yakın bir yere yerleştirin. Agarozu, ardından iğne ucuyla kası delin.

Daha sonra bağırsak lümenine yerleştirin ve 0,5 ila 1,0 nanolitre Clostridioides difficile enjekte edin. Enjekte edilen larvaları izlemek için bir floresan mikroskobu kullanın ve konfokal görüntüleme için uygun şekilde enjekte edilen larvaları almak için esnek bir Mikro yükleyici ucu kullanın.