JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:28 dk. • September 26th, 2025
Patojenik bir anaerobik bakteri olan Clostridioides difficile ile enfekte olmuş bir bağırsağa sahip ötenazi uygulanmış bir zebra balığı larvası ile başlayın.
Larvanın üst sırt gövdesini sabitleyin ve iç organları ortaya çıkarmak için başını çıkarın.
Orta dorsal gövdeyi sabitleyin ve bağırsağı vücut boşluğundan nazikçe izole edin.
İzole edilmiş bağırsağı tampon içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Dokuyu bozmak ve bağırsak mikroplarını serbest bırakmak için bir havaneli kullanarak bağırsağı homojenize edin.
Homojenatı, antibiyotiklerle desteklenmiş seçici yetiştirme ortamı içeren bir tüpe aktarın.
Homojenatı anaerobik bir odada inkübe edin.
Anaerobik koşullar aerobik bakterilerin büyümesini engellerken, antibiyotikler özellikle doğal anaerobik bağırsak mikroplarının büyümesini hedefler ve baskılar.
Clostridioides difficile bu antibiyotiklere direnç gösterir ve anaerobik koşullar altında çoğalır.
Yetiştirme ortamındaki besinler ve büyüme faktörleri, hücre bölünmesini daha da teşvik ederek canlı Clostridioides difficile'nin büyümesini sağlar.
Enfekte zebra balığı larvalarına ötenazi yapıldıktan sonra, zebra balığını hareketsiz hale getirmek için zebra balığı larvalarının dorsal gövdesine başa yakın bir iğne sokun. Bir neşterle solungaçların arkasındaki kafayı çıkarın.
Sırt gövdesinin ortasına ikinci bir iğne sokun. Zebra balığının karnına üçüncü bir iğne sokun ve bağırsağı vücut boşluğundan dışarı çekin. 10 ila 15 bağırsağı 200 mikrolitre steril 1X PBS içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir mikroenjeksiyon iğnesi kullanın.
Dokuyu bozmak ve homojenatlar hazırlamak için bağırsakları bir havaneli ile homojenize edin. Tüm bağırsakları tamamen bozmak için havaneli tüpün dibine ulaştığından emin olun. Homojenatlara, taurokolatlı veya taurokolatsız D-sikloserin ve sefoksitin içeren Clostridioides difficile yetiştirme ortamını ekleyin ve anaerobik bir odada inkübe edin.