JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:45 dk • September 26th, 2025
Mikromekanik bir valf ile ayrılmış büyüme ve ilaç odalarına sahip mikroakışkan çipleri alın.
Vahşi tip ve TMP'ye dirençli mutant yükleyin E. coli suşları, ortamda süspanse edilmiş, basınç kullanarak büyüme odalarına yükleyin, burada Trimetoprim (TMP) test edilen antibiyotiktir.
Daha sonra, bakterilerde hücresel stresi indüklemek için ilaç odalarını düşük konsantrasyonda TMP içeren ortamlarla doldurun.
TMP'nin büyüme odalarına difüzyonuna izin vermek için mikromekanik valfi çalıştırın ve TMP'nin bakterilere girmesini sağlayın.
Çipleri ters mikroskop tablasına monte edilmiş inkübatöre yerleştirin ve hızlandırılmış görüntülemeyi başlatın.
Vahşi tip E. coli'de TMP, dihidrofolat redüktaz enzimine bağlanarak dihidrofolat bağlanmasını önler ve stres kaynaklı filamentasyona ve bakteri çoğalmasının azalmasına neden olur.
Bununla birlikte, mutant suşun değiştirilmiş DHFR yapısı, TMP bağlanmasını önleyerek normal çoğalmaya izin verir.
Hızlandırılmış görüntüleri gözlemleyin.
Vahşi tip E. coli , TMP tedavisi altında filamentasyon ve azaltılmış çoğalma sergilerken, mutant suş, antibiyotik direncini gösteren normal morfoloji ve çoğalma sergiler.
Günlük dondurulmuş numuneyi oda sıcaklığında beş dakika çözdürdükten sonra, yeni bir test tüpünü taze M9 ortamıyla aşılayın.
Numuneyi gece boyunca 37 santigrat derecede çalkalayan bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, mikrobiyal numuneyi on kat seyreltmek için M9 ortamını kullanın ve mikrobiyal numune kabını beş PSI'da basınçlandırarak mikroakışkan cihaza yükleyin. Ardından, M9'u TMP kabı ile beş PSI'da basınçlandırarak TMP içeren ortamı çipe yükleyin.
Mikroakışkan çip üzerindeki iki hazne arasındaki mikro mekanik valfi 15 dakika çalıştırarak mikrop ve ilaç arasındaki karışımı gerçekleştirin. Son olarak, mikroakışkan çipi ters çevrilmiş mikroskop üzerine monte edilmiş mikroskop inkübatörüne yerleştirin. Bir CCD kamera ile sekiz saat boyunca her saat başı büyüme odasındaki hücre görüntülerini elde edin.
Hücre numarası verilerini metin protokolüne göre hesaplayın.