JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 3:28 dk • September 26th, 2025
Asidik pH'lı steril bir büyüme ortamı içeren bir tank alın.
Bitki fideleri içeren bir ağ ekranı tanka aktarın.
Gaz değişimine izin verirken steriliteyi korumak için bir kapak ve gözenekli bantla kapatın.
Ortamı havalandırmak için çalkalayarak inkübe edin.
Bakteriyel kontaminasyon olmadığını gösteren bulanıklık olup olmadığını kontrol etmek için ortamı inceleyin.
Bir numuneyi bir kültür plakasına yerleştirin ve bakteri üremesinin eksikliğini gözlemlemek için inkübe edin, bu da kontamine edici bakterilerin olmadığını doğrular.
Bir bitki patojeni olan Agrobacterium ile aşılayın ve inkübe edin.
Bitki kökünden türetilen sinyal molekülleri ve asidik pH, bakteri zarına bağlı bir sensör proteinini aktive eder.
Aktivasyon, kök yüzeylerine bakteri bağlanması için proteinler üreten gen ekspresyonunu indükler.
Bağlanmanın ardından Agrobacterium, transfer DNA (T-DNA) olarak bilinen bir DNA parçasını bir salgılama sistemi aracılığıyla bitki hücrelerine iletir.
Bitki genomuna entegre edildikten sonra T-DNA, bakteri kolonizasyonunu artıran sinyal moleküllerini sentezler.
Sterilize edilmiş bir akış başlığında, 18 mililitre otoklavlanmış sıvı MS ortamını steril kapaklı steril silindirik cam tanklara dökün.
Daha sonra, 10 ila 14 günlük fidelerin bulunduğu her bir ağ karesini yarı katı ortamın Petri kabından hidroponik silindirik bir tanka nazikçe aktarmak için steril forseps kullanın. Burada gösterilen fideler yoncadır. Gözenekli cerrahi bant kullanarak kapakları tankların üzerine kapatın.
Daha sonra fideleri 22 ila 24 santigrat derecede, 16 saatlik bir fotoğraf periyodu ile ve 50 rpm'de çalkalayarak yetiştirin. Aşılamadan önce, fidelerin bulunduğu tankı olası kontaminasyon açısından dikkatlice inceleyin. Kirlenmemiş tanklardaki ortam berrak ve şeffaf olmalıdır.
Tanklar kirlenme nedeniyle bulanıksa, bunları atın ve tankların geri kalanını numaralandırın. Numaralandırılmış her tanktan 20 mikrolitre hidroponik ortam numunesi alın ve Luria suyu veya LB agar içeren bir Petri kabına yerleştirin. Çanağı 28 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.
Derhal her bir numaralı hidroponik tankı, her bir numaralı hidroponik tanka 50 mikrolitre Agrobacterium tumefacians süspansiyonu ile aşılayın. Fideleri ve A. tumefacians bakterisini 22 ila 24 santigrat derecede, 16 saatlik bir fotoğraf periyodu ve 50 rpm'de çalkalayarak birlikte yetiştirin. Hidroponik büyüme ortamının sterilitesini doğrulamak için 12 ve 28 saatlik inkübasyondan sonra benekli LB plakasını inceleyin.
Herhangi bir kontaminasyon varsa, daha sonraki sonraki analizler için bakteri ile aşılanmış ilgili numaralı tankı kullanmayın.