E. coli Sferoplastların Hazırlanması

JoVE Encyclopedia of Experiments

Mikrobiyoloji

0 görüntüleme • 4:30 dk • September 26th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir E. coli kültürünü ele alalım.

Kültürü taze ortamda seyreltin ve bakteri bölünmesini teşvik etmek için inkübe edin.

Daha sonra, kültürü bir bakteri bölünmesi inhibitörü içeren ortamda seyreltin ve inkübe edin.

Bakteriler bölünmeden büyümeye devam ederek uzun filamentler oluşturur.

Kültürü taze bir tüpe aktarın, ardından filamentleri peletlemek ve süpernatanı çıkarmak için santrifüjleyin.

Sferoplast lizisini önlemek için peleti ozmotik bir stabilizatörle yıkayın. Çözeltiyi çıkarın.

Sırayla tampon, lizozim, DNaz ve bir şelatlama maddesi ekleyin. Kuluçkaya yatırın.

Şelatlama maddesi, filamentin dış zarının dengesini bozar.

Lizozim, açıkta kalan peptidoglikan tabakasını bozarak filamentlerin şeklini kaybetmesine ve sferoplast adı verilen küresel yapılar oluşturmasına neden olur.

Ek olarak, DNaz, hasarlı filamentlerden salınan kirletici DNA'yı bozar.

Ozmotik stabilizatörü tekrar ekleyin, karıştırın ve inkübe edin.

Süspansiyonu tampon ve santrifüj içeren bir tüpe aktarın.

Fazla süpernatanı çıkarın ve aşağı akış analizi için sferoplastları tamponda yeniden süspanse edin.

Bir gecelik kültür oluşturmak için, tek bir bakteri kolonisini katı bir agar kültür plakasından iki ila üç mililitre yüzde üç triptikaz soya suyu, TSB içeren 14 mililitrelik bir kültür tüpüne aktarmak için steril bir mikropipet ucu kullanın, çalkalama ile 37 santigrat derecede 16 ila 21 saatlik bir inkübasyon için. Gram-negatif E. coli sferoplastları hazırlamak için, gece kültürünü bir ila 100 oranında ve 25 mililitrelik bir şişede 250 mililitre TSB'yi seyreltin ve bakterileri 2,5 saat daha çalkalayan inkübatöre geri koyun. Çözelti 600 nanometrede 0,5 ila 0,8'lik bir optik yoğunluğa ulaştığında, mililitre başına 60 mikrogramlık bir nihai etkili konsantrasyon ile ikinci bir 2,5 saatlik inkübasyon için yeni bir 250 mililitrelik şişede taze TSB'de bir ila on oranında seyreltin.

Işık mikroskobu altında 1000x büyütmede görselleştirildiği gibi, yaklaşık 50 ila 150 mikrometre uzunluğunda tek hücreli filamentler üretmek. Filamentleri toplamak ve süpernatanı boşaltmak için bakteri çözeltisini santrifüjleyin. Filamentleri, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek bir mililitre 0,8 molar sakaroz ilavesiyle yıkayın.

Bir dakika sonra, peleti bozmadan süpernatanı atın ve belirtilen reaktifleri filamentlere ilgili sırayla ekleyin. Oda sıcaklığında on dakika sonra, çözeltiyi elle hafifçe döndürürken, bir dakikalık bir süre boyunca yavaş yavaş bir mililitre A çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin, ardından filament süspansiyonunu yedi mililitre dört santigrat derece çözelti B içeren iki adet 15 mililitrelik konik tüp arasında iki eşit parçaya bölün. Daha sonra, filamentleri santrifüjleme ile peletleyin ve peletleri bozmadan süpernatanın bir ila iki mililitresi hariç tümünü dikkatlice çıkarmak için serolojik bir pipet kullanın.

Peletleri nazikçe yeniden süspanse etmek için bir p1000 mikropipet kullanın. Işık mikroskobu ile sferoplast oluşumu için numunenin küçük bir kısmını kontrol edin. Sferoplast daha sonra eksi 20 santigrat derecede bir haftaya kadar veya üç donma çözülme döngüsünden geçene kadar saklanabilir.

07:59

Proteotoksik Stresör ile Escherichia coli Tedavisinden Sonra Protein Agregalarının Ekstraksiyonu ve Görselleştirilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:29

Escherichia coli'de Antibiyotik Kalıcılığının Popülasyon ve Tek Hücre Analizi

İlgili videolar

0 Görüntüler

15:00

Günlük Transferler, Popülasyonların Arşivlenmesi ve Escherichia coli ile Uzun Vadeli Evrim Deneyinde Uygunluğun Ölçülmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:33

Yüksek Voltajlı Elektroporasyon Kullanılarak Bakterilerin Hazırlanması ve Dönüşümü

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:02

Gram-negatif bakterilerden sferoplastların üretimi

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:10

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü Escherichia coli Ve Vibrio cholerae

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:19

Bir Siteye Özel çoğaltma Blokaj içinde uyaran E. E. coli Bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sisteminin Kullanılması

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:28

Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:34

Ayagin Gram-negatif bakterilerde temel Metal alımı: x-ışını Floresans, Radioisotopes ve hücre ayırma

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:46

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 22 Ağustos 2026