E. coli Sferoplastların Hazırlanması

Bir E. coli kültürünü ele alalım.

Kültürü taze ortamda seyreltin ve bakteri bölünmesini teşvik etmek için inkübe edin.

Daha sonra, kültürü bir bakteri bölünmesi inhibitörü içeren ortamda seyreltin ve inkübe edin.

Bakteriler bölünmeden büyümeye devam ederek uzun filamentler oluşturur.

Kültürü taze bir tüpe aktarın, ardından filamentleri peletlemek ve süpernatanı çıkarmak için santrifüjleyin.

Sferoplast lizisini önlemek için peleti ozmotik bir stabilizatörle yıkayın. Çözeltiyi çıkarın.

Sırayla tampon, lizozim, DNaz ve bir şelatlama maddesi ekleyin. Kuluçkaya yatırın.

Şelatlama maddesi, filamentin dış zarının dengesini bozar.

Lizozim, açıkta kalan peptidoglikan tabakasını bozarak filamentlerin şeklini kaybetmesine ve sferoplast adı verilen küresel yapılar oluşturmasına neden olur.

Ek olarak, DNaz, hasarlı filamentlerden salınan kirletici DNA'yı bozar.

Ozmotik stabilizatörü tekrar ekleyin, karıştırın ve inkübe edin.

Süspansiyonu tampon ve santrifüj içeren bir tüpe aktarın.

Fazla süpernatanı çıkarın ve aşağı akış analizi için sferoplastları tamponda yeniden süspanse edin.

Bir gecelik kültür oluşturmak için, tek bir bakteri kolonisini katı bir agar kültür plakasından iki ila üç mililitre yüzde üç tri