Gram Pozitif Bakteri Bacillus megaterium'dan Protoplast Üretimi

Gram pozitif bir bakteri olan Bacillus megaterium kültürünü ele alalım.

Kültürü taze ortamda seyreltin ve bakteri bölünmesini teşvik etmek için çalkalayarak inkübe edin.

Kültürü bir tüpe aktarın ve bakterileri peletlemek için santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve protoplast lizisini önlemek için peleti ozmotik stabilizatörler içeren ortamlarda yeniden süspanse edin.

Yeniden süspanse edilen çözeltiyi bir şişeye aktarın, lizozim ekleyin ve çalkalayarak inkübe edin.

İnkübasyon sırasında lizozim, bakterilerin kalın peptidoglikan hücre duvarını bozar.

Hücre duvarı bozuldukça, bakteriler çubuk şeklindeki bir formdan sadece plazma zarı ile sınırlanan küresel cisimlere dönüşür ve protoplastlar oluşturur.

Süspansiyonu mikroskop altında görselleştirin.

Yuvarlak şekilli bakteriler protoplast oluşumunu doğrularken, şişmiş çubuk şeklindeki bakteriler eksik sindirimi gösterir.

Çözeltiyi bir tüpe aktarın ve protoplastları peletlemek için santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve daha fazla analiz için protoplastları ozmotik stabilizatörler içeren taze ortamda yeniden süspanse edin.

Gram-pozitif B. megaterium protoplastları hazırlamak için, gece boyunca bakteri kültürünü 250 mililitrelik bir şişede 100 mililitre yüzde üç TSB'de bir ila 1000 oranında seyreltin ve 37 santigrat derecede çalkalayarak 4,5 saatlik bir inkübasyon yapın. Sıvı kültür 600 nanometrede 0,9 ila 1,0 optik yoğunluğa ulaştığında, bakterileri santrifüjlemeleri için iki adet 50 mililitrelik konik tüp arasında bölün ve süpernatanları aspire etmek için bir sirolojik pipet kullanın. Peletleri tüp başına 2,5 mililitre protoplast ortamında yeniden süspanse edin ve süspansiyonu 125 mililitrelik bir şişede kültür için tek bir konik tüpe çekin.

Çalkalayarak 37 santigrat derecede bir saatlik inkübasyon için kültüre mililitre lizozim başına bir mililitre beş miligram ekleyin. Protoplastın büyümesinin ışık mikroskobu altında izlenmesi ve küreler yerine şişmiş çubuklar olarak görünen bakteriler gibi düzensizliklerin not edilmesi. İnkübasyonun sonunda, süspansiyonu santrifüjleme için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve peleti beş mililitre protoplast ortamında yeniden süspanse edin.

Protoplast daha sonra eksi 20 santigrat derecede bir haftaya kadar veya üç donma çözülme döngüsünden geçene kadar saklanabilir.