Dev Veziküller İçinde Tek Hücreli Bakteri Kültürü

Biyotinlenmiş fosfolipidler de dahil olmak üzere fosfolipidlerden oluşan destekli bir zarla kaplanmış odacıklı bir cam slaytla başlayın.

Çift tabaka üzerindeki biyotine bağlanan nötravidin ile inkübe edin. Fazla nötravidini çıkarmak için yıkayın.

Dev veziküller veya GV'ler içeren bir besin ortamı ekleyin. Her GV, tek bir bakteri hücresini kapsülleyen küresel, mikron boyutunda bir lipid çift katmanlı veziküldür ve kapalı bir ortamda bireysel hücre davranışını incelemek için bir model görevi görür.

Nötravidin, biyotinlenmiş GV lipidlerine bağlanarak, statik koşullar altında stabil, uzun süreli gözlem için vezikülleri desteklenen membrana sabitler.

Hidrasyonu korumak ve kirlenmeyi en aza indirmek için hazneyi kapatın.

Fizyolojik koşulları simüle etmek ve mikroskop altında gözlemlemek için slaytı bir ısıtma platformu ile donatılmış bir mikroskop tablasına yerleştirin.

Ortamdaki besinler, zamanla bakteri üremesini desteklemek için GV'ye yayılır.

Bu kurulum, sınırlı vezikül mikro ortamlarında tek hücreli bakteri üremesinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine olanak tanır.

Destekleyici iki katmanlı membran üzerindeki dev vezikülleri hareketsiz hale getirmek için, oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyon için dış sulu dev vezikül çözeltisi içinde deliğe 10 mikrolitre nötravidin verin.

İnkübasyonun sonunda, deliği 200 milimolar glikoz ile desteklenmiş 20 mikrolitre LB ortamı ile iki kez nazikçe yıkayın ve dev vezikül çözeltisinin tüm hacmini odadaki deliğe ekleyin. Ardından deliği 18 x 18 milimetrelik bir kapak camı ile kapatın. Dev veziküller içindeki bakteri üremesini izlemek için, ters çevrilmiş bir mikroskopta 40X objektifini seçin ve odayı mikroskop ısıtma aşaması sistemine yerleştirin.

Daha sonra bakteri hücresi içeren dev vezikülleri odadaki statik koşullar altında 37 santigrat derecede altı saat inkübe edin, bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken kamera ile her 30 dakikada bir bakteri hücresi büyümesinin görüntülerini yakalayın ve kaydedin.