Etilen Salan Bir Bileşik Kullanarak Etilene Bakteriyel Tepkinin Araştırılması

Selüloz üreten bakterilerle önceden aşılanmış büyüme ortamı içeren çok oyuklu bir plaka ile başlayın.

Arıtılmış kuyuda, ortama 2-kloroetilfosfonik asit (CEPA) eklenir.

Gaz değişimini önlemek ve inkübe etmek için plakayı kapatın.

İnkübasyon sırasında CEPA, gaz halindeki bir molekül olan etileni hidrolize eder ve serbest bırakır.

Etilen, selülozu sentezlemek için sitozolik UDP-glikozu kullanan bakteriyel selüloz sentazı aktive eder.

Zamanla, bakteriler selülozu zarlarından çıkarırlar.

Bu, hava-sıvı arayüzünde bakterilerin kendi kendine birleşmesini teşvik ederek yüzen selüloz bazlı bir biyofilm veya pelikül oluşturur.

İnkübasyonun ardından pelikülleri yeni, çok oyuklu bir plakaya aktarın. Alkali bir çözelti ekleyin ve hücreleri parçalamak için daha yüksek bir sıcaklıkta inkübe edin.

Alkali çözeltiyi çıkarın. Selülozu korurken hücresel kalıntıları gidermek için çalkalayarak tekrar tekrar yıkayın.

Pelikülleri kurutun ve tartın. CEPA ile muamele edilmiş numunelerde kontrole kıyasla daha yüksek bir kuru ağırlık, etilene yanıt olarak bakteriyel selüloz üretiminin arttığını gösterir.

Pelikül tahlili, bakteriyel selüloz üretimi için standart bir analiz aracıdır. PH ve morfolojik analiz metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Hazırlık aşamasında, başlangıç kültürlerinden hücreleri üç kopya halinde toplayın ve bir Petroff-Hauser Sayım Odası kullanarak hücreleri ölçün.

Ardından, farklı CEPA konsantrasyonlarına sahip dört orta ana karışım hazırlayın. Her ana karışım için, 60 mililitre pH 7 SH ortamını ayırın ve 0, 0.01, 0.1 veya 1.0 milimolar nihai CEPA konsantrasyonlarını elde etmek için 120 mikrolitre 0, 5, 50 veya 500 milimolar CEPA stok çözeltisi ekleyin. Şişeleri döndürerek bu ortamları karıştırın.

Üçlülerin her biri için bir set ortama ihtiyaç vardır ve steril kontrol olarak işlev görmesi için dördüncü bir sete ihtiyaç vardır. Bu nedenle, her 60 mililitrelik ortam hazırlığını dört adet 14 mililitrelik alikota bölün. Daha sonra, mililitre başına 100.000 hücrelik nihai bir konsantrasyon için ilgili starter kültürleriyle aşılamadan önce 14 mililitrelik alikotları önceden soğutun.

Selüloz üretimini önlemek için aşılanmış tüm tüpleri buz üzerinde tutun. Kalan 14 mililitrelik alikotları steril kontrol kuyuları için kullanın. Şimdi, her 14 mililitrelik ana karışımdan, analiz edilen başlangıç kültürü başına toplam dört yüklü plaka için steril 24 oyuklu bir plakanın altı kuyucuğuna iki mililitrelik alikot yükleyin.

Plakaları dikkatlice parafin filmle kapatın ve 30 santigrat derecede yedi gün boyunca statik olarak inkübe edin. Plakadan bir pelikül toplamak için, karşı kenarı yükseltmek için pelikülün bir tarafına bastırın ve forseps ile alın.

Daha sonra, pelikülleri ayrı ayrı altı oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Hücreleri parçalamak için 20 dakika boyunca 80 santigrat derecede 12 mililitre 0.1 normal sodyum hidroksit ile tedavi edin. Daha sonra, sodyum hidroksiti çıkarın ve işlenmiş pelikülleri altı oyuklu bir plakada çalkalayarak 24 saat boyunca 12 mililitre ultra saf su ile iyice yıkayarak nötralize edin.

Bu inkübasyon sırasında suyu her altı saatte bir değiştirin. Kuluçka bittiğinde peliküller beyaz olmalıdır. Daha sonra pelikülleri silikon matların üzerine yerleştirin ve kuru ağırlık ölçümüne hazırlamak için 50 santigrat derecede 48 saat kurutun.