Bir Bakteriyel Konakçıda İntihar Plazmidinin Amplifikasyonu

Bir bakteri peleti ile başlayın. Bakteriler, bir başlatıcı proteini kodlayan bir gen içerir, ancak bir antibiyotik direnç geninden yoksundur.

Hücresel bozulmayı en aza indirmek için peleti soğutulmuş suda yeniden süspanse edin.

Bir antibiyotik direnç geni ve bir hedef gen taşıyan bir plazmit alın. Bu plazmide intihar plazmidi denir çünkü başlatıcı protein olmadan çoğalamaz.

Plazmidi bakteri süspansiyonuna ekleyin.

Süspansiyonu soğutulmuş bir küvete aktarın.

Bakteri zarını geçici olarak bozan ve plazmidin girmesine izin veren yüksek voltajlı bir darbe uygulayarak elektroporasyonu başlatın.

Geri kazanım ortamı ekleyin ve karışımı bir kültür tüpüne aktarın.

Sallayarak inkübe edin.

Antibiyotiği içeren bir agar plakası alın ve kültürü plakalayın.

Bakteriyel başlatıcı protein, replikasyonun orijinine bağlanarak plazmidin bir antibiyotik direnç proteinini kopyalamasını ve eksprese etmesini sağlar.

Bu, plazmitli bakterilerin hayatta kalmasına ve büyümesine izin vererek plazmit amplifikasyonunu kolaylaştırır.

Bakteri kültürünü 5.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleme ile pelet haline getirin. Peleti soğutulmuş damıtılmış suda bekletin ve temizleme işlemini iki kez daha tekrarlayın.

Bakteri süspansiyonunu mikrofüj tüplerine aktarın ve santrifüjlemeyi 14.000 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca tekrarlayın. Peleti soğutulmuş suda yeniden süspanse ettikten sonra, yaklaşık 3,5 mikrolitre ligasyon karışımı ekleyin ve buz üzerinde beş dakika inkübe edin. İçeriği soğutulmuş iki milimetre boşluklu bir elektroporasyon küvetine aktarın.

Elektroporasyondan sonra SOC ortamını ekleyin ve içeriği bir kültür tüpüne aktarın. 200 RPM'de çalkalayarak 30 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Dönüştürülmüş hücreleri kloramfenikol ile desteklenmiş LB agar plakalarına yerleştirin.