Gram-Negatif Bakterilerin Genomik Transpozon Eklemeleri ile İzolasyonu

Çiftleşen donör ve alıcı Gram-negatif bakteri popülasyonunun donmuş bir kültürünü buz üzerinde çözerek başlayın.

Alıcı hücreler, antibiyotik kanamisin için bir direnç geni içeren kısa DNA segmentleri olan transpozonları taşır. Bu transpozonlar, konakçı genomuna rastgele entegre edilir.

Kültürü, kanamisin içeren, ancak donöre özgü besinler içermeyen, besin açısından zengin bir agar plakasına ekleyin.

Steril boncuklar ekleyin ve kültürü eşit şekilde yaymak için plakayı hafifçe döndürün.

Boncukları çıkarın ve inkübe edin. Alıcı bakteriler besinleri kullanır, ancak yalnızca entegre transpozonlara sahip olanlar kanamisine direnerek koloni oluşumuna yol açar.

Transpozonsuz donör ve alıcı bakteriler büyüyemez.

Benzersiz transpozon eklemelerine sahip alıcı bakterilerin sayısını tahmin etmek için koloni oluşturan birimleri sayın.

Taze ortam ekleyin ve bakteri popülasyonunu toplayın.

Bakterileri peletlemek ve süpernatanı atmak için santrifüjleyin.

Bakteriyel canlılığı korumak için peleti kriyoprotektan içeren ortamda yeniden süspanse edin.

Donmuş çiftleşmenin bir kısmını buz üzerinde çözün. Daha sonra, kanamisin ile desteklenmiş her 30 x 150 milimetrelik Luria-Bertani agar plakasına 150 mikrolitre seyreltmeyi yaymak için steril cam boncuklar kullanın.

Fazla çiftleşme içeren kullanılmış tüpü atın ve plakaları 37 santigrat derecede 14 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, transpozon kütüphanesindeki toplam mutantları tahmin etmek için her plakada koloni oluşturan birimleri sayın. Tüm plaka grubu için koloni sayısı tahminini belirlemek için en az üç plakanın %20'sini sayın.

Tahmini koloni verimini hesapladıktan sonra, her plakaya üç ila beş mililitre LB ekleyin ve steril bir kazıma aleti kullanarak bakterileri kazıyın. Bakteri süspansiyonlarını tüm plakalardan 50 mililitrelik konik tüplere çekin ve süspansiyonları yedi dakika boyunca 5.000 kez G'de santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı atın ve peleti% 30 gliserol ile desteklenmiş beş mililitre LB içinde yeniden süspanse edin.

Ardından, transpozon kitaplığının bir mililitrelik alikotlarını dondurarak saklama şişeleri içinde yapın ve bunları eksi 80 santigrat derecede saklayın.