JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:29 dk. • September 26th, 2025
Önceden yetiştirilmiş RNA interferansı veya RNAi eksprese eden bakterileri içeren bir plaka ile başlayın.
Bu bakteriler, konakçıda spesifik gen ekspresyonunu inhibe etmek için bir antibiyotik direnç geni ve çift sarmallı RNA veya dsRNA üreten bir hedef gen eki içeren plazmitler taşır.
Steril bir iğne kullanarak kolonileri antibiyotik takviyeli bir ortam içeren derin kuyulu bir plakaya aktarın.
Derin kuyucukların havalandırma sağladığı homojen bakteri üremesi için plakayı çalkalayarak inkübe edin.
Antibiyotik, plazmitten yoksun bakterileri ortadan kaldırarak sadece plazmit taşıyan bakterilerin hayatta kalmasını sağlar.
Bakterileri ayırmak için plakayı santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
Bakterileri stabilize etmek için tamponlu bir salin solüsyonunda yeniden süspanse edin.
Yeniden süspanse edilen bakterileri, hem antibiyotik hem de indükleyici ile desteklenmiş, besin açısından zengin ortam içeren çok oyuklu bir plakaya dağıtın.
Antibiyotik, plazmit taşıyan bakterileri seçerken, indükleyici dsRNA ekspresyonunu tetikler.
RNAi eksprese eden bakterilerle tohumlanan plaka, daha ileri tahliller için hazırdır.
24 oyuklu derin oyuklu bir plakanın tek bir kuyucuğunda birden fazla RNAi bakteri suşunu paralel olarak test etmek için, önceden hazırlanmış bakteri içeren RNAi'nin her bir klonundan tek bir koloniyi dört mililitre karbenisilin takviyeli LB'ye aşılayın. Plakaları, 16 saat boyunca 37 santigrat derece ve 950 rpm'de çok kuyulu plakalar için optimize edilmiş çalkalayan bir inkübatöre yerleştirin, Daha sonra bakterileri 2.000 g'da 5 dakika santrifüj ederek toplayın. Plakayı ters çevirerek ve kuvvetlice sallayarak süpernatanı boşaltın.
100 mikrolitre S Bazal kullanarak RNAi bakterilerini yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilen bakterileri, IPTG ve karbenisilin ile desteklenmiş çok oyuklu bir NGM plakasının uygun sayıda kuyucuğuna pipetleyin ve plakanın kurumasını bekleyin.