JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 3:27 dk • September 26th, 2025
Bir antibiyotikle ön işleme tabi tutulmuş bir E. coli kültürü ile başlayın.
Bu antibiyotik hücre bölünmesini bloke ederek DNA içeriği artmış uzun ipliksi hücrelerin oluşumuna neden olur.
Kültürün bir kısmını besin açısından zengin bir agar plakasına koyun ve inkübe edin.
İpliksi hücreler sürekli büyümeye rağmen bölünmezler; Sadece ipliksi olmayan hücreler koloniler oluşturur ve bu da düşük koloni sayılarına neden olur.
Kalan bakteri kültürünü seyreltin ve floresan DNA bağlayıcı bir boya ekleyin. Daha sonra karanlıkta kuluçkaya yatırın.
Boya hücrelere girer ve DNA'ya bağlanır.
Numuneyi vorteksleyin ve ardından bir akış sitometresinden geçirin.
Her hücreden saçılan ışık miktarı, boyutuna karşılık gelir.
Benzer şekilde, boyaya bağlı nükleik asitlerden yayılan floresan, bakteri DNA içeriğini gösterir.
Antibiyotikle tedavi edilen hücreler, filamentli büyümeyi ve bölünmeden devam eden DNA replikasyonunu yansıtan artan saçılma ve floresans gösterir.
Bu, hücre bölünmesini inhibe eden antibiyotiklerin neden olduğu bakteri fizyolojisindeki değişiklikleri gösterir.
Taze ortamda 200 mikrolitre kültür numunesinin 10 ila eksi yedinciye kadar on kat seri seyreltme hazırlayın.
Her seyreltme arasında çok nazik vorteksleme veya tüpü ters çevirerek karıştırın. Seçilmemiş LB agaroz plakalarına 100 mikrolitre uygun seyreltme koyun ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, her kültür örneğindeki canlı hücrelerin konsantrasyonunu belirlemek için koloni sayısını sayın.
Tedavi edilmemiş ve tedavi edilmiş hücre kültürleri için zamanın bir fonksiyonu olarak mililitre başına CFU'yu çizin. Kültürün OD 600'ünü bir spektrofotometrede ölçün. Mikrolitre başına yaklaşık 15.000 hücreye karşılık gelen 0.06'da OD 600 içeren bir numune elde etmek için kültür numunesini dört santigrat derecede taze ortamla seyreltin.
DNA boyama için, seyreltilmiş bakteri örneğini mililitre başına 10 mikrogram DNA floresan boya çözeltisi ile bire bir hacim oranında karıştırın ve karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Numunenin enjeksiyonundan önce, numuneyi çok hafif vorteksleyerek veya tüpü ters çevirerek karıştırın. Numuneyi dakikada yaklaşık 120.000 hücre akış hızında akış sitometresine geçirin.
Uygun ayarlarla ileri saçılan ve yandan saçılan ışığın yanı sıra DNA floresan boya/floresan sinyali elde edin.