Bakteriyel Spor Çimlenmesi Sırasında Korteks Bozulmasının Kolorimetrik Tespiti

Bir bakteri sporu, bir şeker ve amino asit polimeri olan peptidoglikan korteks tabakası nedeniyle uykuda kalır.

Çimlenme sırasında korteks, şekerleri çevreleyen ortama salmak için bozulur.

Korteks bozulmasını tespit etmek için, spor çimlenmesi sırasında belirli zaman noktalarında toplanan salınan şekerleri içeren ortamla başlayın.

Referans olarak artan konsantrasyonlarda şeker standartları kullanın.

Standartlar ve numuneler, şekerleri reaktif bir forma dönüştürmek için önceden bir işleme tabi tutuldu.

Şekerlerle reaksiyona giren ve mor renkli bir kompleks oluşturan kolorimetrik bir tespit reaktifi olan Ehrlich reaktifi ile inkübe edin.

Karışımları çok kuyulu bir plakaya aktarın ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak renkli komplekslerin absorbansını ölçün.

Absorbans, şeker konsantrasyonuyla doğru orantılı olan mor renk yoğunluğuna karşılık gelir.

Zaman noktası örneklerinde absorbanstaki bir artış, ilerleyici korteks bozulmasını gösterir.

Standart konsantrasyonlardan bir grafik oluşturun ve numune konsantrasyonlarını ölçün.

Numuneler buz üzerindeyken renk reaktifini hazırlayın. 0.320 gram DMAB'yi 1.9 mililitre buzlu asetik asit içinde çözün. Bu reaktifin zamana, sıcaklığa ve ışığa duyarlı olduğunu ve önceden yapılmaması gerektiğini unutmayın.

DMAB tamamen çözüldükten sonra 100 mikrolitre 10 normal hidroklorik asit ekleyin ve numuneyi vorteksleyin. Ardından beş mililitre buzlu asetik asit ekleyin ve tekrar girdap yapın. Kolorimetrik reaksiyon için, soğutulmuş her korteksin veya kontrol numunesinin 100 mikrolitresini yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Her numuneye 700 mikrolitre taze hazırlanmış renk çözeltisi ekleyin. Numuneleri hemen 37 santigrat derecelik bir su banyosuna aktarın ve numuneleri tam olarak 20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her numunenin 200 mikrolitresini 96 oyuklu berrak bir plakaya aktarın.

Numuneler başlangıçta sarı renkte olmalıdır, ancak korteksin varlığını gösteren indirgeyici şeker mevcutsa mora dönecektir. Burada örneklerin çoğu görünür bir mor renk göstermez. Bununla birlikte, 250, 500 ve 5.000 nanomol örnekleri, negatif kontrol sıfır nanomolden görsel olarak farklı görünmektedir.

Bir plaka okuyucu kullanarak 585 nanometredeki absorbansı belirleyin. 585 nanometrelik bir OD'de ölçüldüğünde, standart örneklerden üretilen sinyal doğrusal bir regresyona en iyi şekilde uyar.