JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:50 dk • September 26th, 2025
Vezikül Çekirdeklendirici Peptit veya vezikül oluşumunu destekleyen kısa bir peptit olan VNp ile etiketlenmiş rekombinant proteinleri kodlayan bir bakteri türünün kültürüyle başlayın.
Kültüre bir indükleyici ekleyin ve inkübe edin. İndükleyici, protein ekspresyonunu tetikler.
VNp, iç zara gömülür ve VNp etiketli proteinleri tomurcuklanan veziküllere kapsülleyerek zar eğriliğini destekler.
Vezikül bakımından zengin ortamı bir tüpe aktarın. Vezikül bakımından zengin süpernatanı ayırmak için santrifüjleyin.
Ardından, kalan kirleticileri gidermek için süpernatanı filtreleyin.
Daha sonra membran yüzeyindeki vezikülleri yakalamak için süzüntüyü başka bir membran filtreden geçirin.
Membranı bir tabağa koyun ve fosfat tamponlu salin ekleyin.
Vezikülleri yavaşça ayırın ve süspansiyonu temiz bir tüpe aktarın.
Vezikül zarlarını bozmak ve proteinleri serbest bırakmak için süspansiyonu sonikleştirin.
Membran parçalarını ayırmak için lizatı santrifüjleyin.
Ortaya çıkan süpernatan, analize hazır, saflaştırılmış rekombinant proteinler içerir.
Mililitrede 20 mikrograma veya 84 mikromolara kadar nihai bir konsantrasyona IPTG ekleyerek T7 promotöründen rekombinant protein ekspresyonunu indükleyin. İndüksiyon için yeterli zaman geçtikten sonra, hücreleri 3000 g ve 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüjleme ile pelet haline getirin. Uzun süreli depolama için ortam içeren vezikülü sterilize etmek için süpernatanı steril ve deterjan içermeyen 0,45 mikron PES filtreden geçirin.
Vezikülleri daha küçük bir hacme konsantre etmek için, steril vezikül içeren ortamı steril ve deterjan içermeyen 0,1 mikron MCE filtreden geçirin. Ardından, membranı 0,5 ila 1 mililitre steril fosfat tamponlu salin veya PBS ile nazikçe yıkayın ve vezikülleri membrandan dikkatlice çıkarmak için bir hücre kazıyıcı veya plastik yayıcı kullanın. Vezikül konsantresini bir pipet kullanarak yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Saflaştırılmış veziküller 4 santigrat derecede saklanabilir. Veziküler lipid membranlarını bozmak ve proteini serbest bırakmak için uygun bir program kullanarak steril ortamda veziküller içeren proteini sonikasyon yapın. Veziküler kalıntıları gidermek için soniküler süspansiyonu 39.000 g ve 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin.