E. coli'de F Plazmid Transferi ve İkili Antibiyotik Seçimi

Bir transfer geninin bir antibiyotik direnç geni ile değiştirildiği bir F-plazmidi taşıyan donör E. coli hücreleri ile başlayın.

Bu hücreler ayrıca eksik transfer genini kodlayan bir kurtarma plazmidi içerir.

DNA'larında farklı bir antibiyotik direnç geni bulunan eşit hacimlerde alıcı E. coli hücreleri alın.

Her iki kültürü de antibiyotik içermeyen besin ortamında karıştırın ve çalkalamadan inkübe edin.

Donör bakterinin kurtarma plazmidi, transfer genini eksprese ederek donör hücrenin bir F-pilus oluşturmasına izin verir.

Pilus, iki hücre arasında bir köprü oluşturarak donörden alıcıya tek yönlü plazmit transferine izin vererek transkonjuganlar oluşturur.

Çiftleşme çiftlerini bozmak için karışımı vorteksleyin ve daha fazla çiftleşmeyi önlemek için buzun üzerine koyun.

Kültürü, transkonjugan seçilebilir antibiyotikler içeren agar plakalarında tespit edin ve inkübe edin.

Her iki antibiyotiğe dirençli geni de taşıyan transkonjuganlar, her iki antibiyotiğin varlığında hayatta kalır ve koloniler oluşturarak başarılı F-plazmid transferini doğrular.

İki kopya halinde, bir mililitre toplam hacim için 100 mikrolitre donör hücre ve 100 mikrolitre alıcı hücreyi 800 mikrolitre steril LB ortamına ayırın