JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:23 dk • September 26th, 2025
Bir elektron donörü olan L-metiyonin, bir redoks göstergesi olan nitro mavisi tetrazolyum veya NBT ve bir ışığa duyarlılaştırıcı olan flavin mononükleotidi veya FMN içeren tamponlu bir reaksiyon karışımı ile başlayın.
Bu karışımı bakteri peleti ve girdabı içeren bir tüpe ekleyin.
Çözeltiyi bir cam tüpe aktarın.
Şimdi, L-metiyoninden bir elektron kabul eden ve reaktif bir ara madde oluşturan FMN'yi etkinleştirmek için karışımı mor ışıkla ışınlayın.
Bu ara ürün, elektronu çözünmüş moleküler oksijene aktararak bakteri yüzeyinin yakınında reaktif oksijen türleri veya ROS üretir.
Ortaya çıkan ROS, hücresel bileşenlere zarar verir ve bakteri canlılığını azaltır.
ROS ayrıca NBT'yi bakteri yüzeyinin yakınında biriken mavi renkli bir ürün olan formazan'a indirger.
Karışımı bir tüpe aktarın, santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
Formazanı çözündürmek için peleti organik bir çözücü içinde yeniden süspanse edin.
Son olarak, ROS üretimi yoluyla ışığın neden olduğu bakteriyel inaktivasyonu belirlemek için absorbansı ölçün.
Bir hücre peleti elde etmek için Staphylococcus aureus örneklerini daha önce açıklandığı gibi hazırlayın. 75 mililitre fosfat tamponuna 0.1093 gram L-metiyonin, 0.1 gram NBT ve 25 mililitre FMN çözeltisi ekleyin.
Hücre peletlerine ve girdaba değişen FMN konsantrasyonlarına sahip her reaktan çözeltisinden bir mililitre ekleyin. Çözeltileri mor ışık altında 10 dakika boyunca metre kare başına 10 watt'ta ışınlayın. Karışımı 14.000 G'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın.
İndirgenmiş NBT'yi çıkarmak için peleti bir mililitre dimetil sülfoksit içinde yeniden süspanse edin. Absorbansı 560 nanometrede kaydedin.