Name: Dev Fiber Pathway Elektrofizyolojik Kayıtlar D. melanogaster /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Öğrenin, Drosophila melanogaster'da dev fiber yolunda sinaptik iletimi elektrofizyolojik kayıtlarla nasıl izleyeceğinizi. DLM ve TTM kaslarından postsinaptik potansiyeller ölçülerek nöron devrelerinin işlevsel özellikleri değerlendirilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Wellcome Trust hibe LP tarafından desteklenen

1. Ekipman ve Malzeme <ol><li> Bu deneyler, bir uyarıcıdır bir uyarıcı izolasyon ünitesi, iki mikroelektrot amplifikatörler, bir veri toplama sistemi ve toplama bir bilgisayar yazılımı ile oluşan bir standart elektrofizyoloji kurulum kullanın. Ek donanım, Faraday kafesi, bir patlama standında bir stereomikroskopta, bir titreşim izolasyonu tablo, bir ışık kaynağı ve bir kayıt platformu içerir. </li><li> Beş mikromanipülatörler kullanılır. İki mikromanipülatörler, diğer üç mikromanipülatörler sadece iki uyarımı elektrot ve toprak elektrot yerleştirmek için brüt kontrolleri gerektirir kayıt elektrotları konumlandırma için ince kontrolleri gerektirir. DLM kayıt elektrodu için mikromanipülatör hazırlık sonunda kuyruk yerleştirilir (deneyci sol) ve TTM kayıt elektrodu için mikromanipülatör hazırlık deneyci ve yan (biraz deneyci sol) arasına yerleştirilir. Simülasyon elektrotlar yapacak iki mikromanipülatörler hazırlık başkanı (sağ deneyci) yerleştirilir. Toprak elektrot için mikromanipülatör hazırlık uzak tarafında yer alır </li><li> M 40-60 dirençler cam kayıt Mikroelektronlar çekin ve balmumu tarafından desteklenen bir tabak içinde düz olarak saklayın. Stimülasyonu için, elektrolitik (NaOH) bilenmiş iki tungsten elektrot kullanılır. Bir tungsten tel, ya da üçüncü bir elektrolitik fabrikasyon elektrot bir zemin olarak kullanılır. Uyarıcı ve toprak elektrotları ve mikromanipülatörler bağlı hazırlanan deneysel oturumu başlamadan önce oturumun süresi için değiştirilmesi gerekmez. </li></ol> 2. D. Hazırlama melanogaster <ol><li> Donatım ayarlandıktan sonra, sineklerin hazırlamak için zaman. Buz soğutma veya CO 2 ile sinek anestezisi. CO 2 kullanılması durumunda, daha sonra gaz etkilerini deney başlamadan önce eskitmek için yeterli zaman (20mins hakkında) izin. </li><li> Forseps, yaklaşık 45 ° açıyla eğimli yumuşak balmumu bir platform içeren bir çanak bacaklarını hafifçe sineklerin aktarmak için kullanın. (Ama yakın) kayıt cihazları önümüzdeki dört adım uzakta bir diseksiyon mikroskop altında yapılır. </li><li> Bir sonraki adım, balmumu sinek güvence altına alınmasıdır. Yamacında ön bakan yukarı aşağı Orient sinek ventral tarafında. Bir çift güzel forseps kullanarak, çift, bacaklar dışa doğru genişletmek ve balmumu içine itmek. </li><li> Dorsal longitudinal kas, ya da DLM, ve tergotrochanteral kas, veya TTM: kaydedilecek kaslar yer hakkında bilgi edinin. DLMS subkütiküler eki siteleri göğüs orta hat ve anterior dorsal kıllar (ya da setanın) arasındaki bölge ile karşılık gelir. TTM ek siteler arka ve ön supra-alar kıllar dorsal bulunmaktadır. Kanatları, DSB veya TTM lifleri erişim engel kanatları dışa doğru tutun ve 'yapıştırıcı' balmumu olmaz ki emin olun. </li><li> Güzel bir çift forseps kullanarak, burnumun dışa dikkatle çekin ve güvenli balmumu içine çeker. Bu, probosis yumuşak ve kolay baş geri kalanından kopuk olduğundan biraz pratik gerektiren bir kritik bir adımdır. Eğer bu gerçekleşirse, sinek atmak ve baştan başlayın. Gözüyle uyarıcı elektrotlar takarken bu şekilde baş güvenli takdirde sorunlara yol açar. </li></ol> 3. Elektrotlar yerleştirilmesi <ol><li> Sinek balmumu demirlemiş sonra, Faraday kafesi içinde bulunan stereomikroskop altında ekli sinek çanak aktarın. Orient yana uçan sinek deneyci sağ kafa ile. </li><li> Bir sonraki adım, elektrotlar eklemek için. Zemin ve uyarıcı elektrotlar mikroskop ile bakmadan eklenebilir. İyi kayıtları kesin Impalement güveniyor, mikromanipülatörler işleme uygulamaya iyi bir fikirdir. Elektrotlar yardımı ile uygun yerleştirilmesi ve sonraki kayıtları kolaylaştırmak için mikromanipülatörler ekleme siteleri yakın getirin. </li><li> Mikromanipülatör ayar çarkları kullanarak karın arka ucunu toprak elektrot indirin. Beyindeki bilenmiş tungsten uyarıcı elektrotlar yerleştirmek için, sadece bir sineğin gözleri dokunur, böylece bir elektrot ucu konumuna mikromanipülatör kullanın. Diğer iki elektrot sadece her bir gözün dış dokunmadan bu nedenle de aynı işlemi yapın. Sonra elektrotlar itmek, sırayla, her bir göz ile baş kapsülü (yaklaşık 2-3mm) arkasında yer alan elektrot uçları beyne ulaşmasına. </li><li> Doğru yerleştirilen elektrotlar Dev Fiber sistemi aktive eder. Uyarıcı elektrotlar doğru yerleştirildiğinden olduğunu test etmek için, 30-60 (0.03 ms) kısa bir uyarıcıyı uygulamayaV uyarıcı elektrotlar, kanat ve uçuş / bacak kas seyirmesi hareketi göz arasında ' </li><li> Bir sonraki adım, Hamilton veya ısı çekti plastik şırınga kullanarak 3M KCl ile cam Mikroelektronlar geri dolgu ve ince kontrol mikromanipülatörler içine yerleştirin. Düzgün yerleştirildiğini Mikroelektronlar deneyler birkaç tur için kullanılabilir. </li><li> Ilk kayıt elektrodu DLM lif eklenecektir. Bilateral simetrik iki DLMS vardır; her biri altı ayrı kas lifleri oluşmaktadır. Altı lifleri herhangi kayıtları yapılır, ancak en sık kullanılan DLM lifleri torasik manikür dorsal tarafında yoluyla iyi erişilebilirlik nedeniyle 45a ve 45b ve aynı motorneuron hem lifleri innerve olduğu gerçeği . </li><li> En uzak tarafında mikromanipülatör kullanarak, DLM fiber 45a veya b. bir kayıt elektrodu eklemek Platformunun eğimi DLM elektrot penetrasyon yardımcıları ~ 60-90 ° açı, dorsal manikür girmek için izin verir. Osiloskop modunda yazılımı kullanın ve göğüs kafesi içine kayıt elektrotları eklerken bilgisayar monitörü bakmak. Temel elektrot bir kas girdiğinde yakın sıfır veya negatif bir değere düşecektir. Kas yanıtı gözlemlemek olmadığını görmek için tek bir uyaran ile test. </li><li> Size en yakın TTM diğer kayıt elektrodu takın. Bu elektrot, önünüzde kas eki sitenin konumu nedeniyle, yanal eklenir. Yine monitör izleme elektrot kas olduğunu gösterir bu kez tek bir uyarıcı ve test yaparken gözlemliyoruz. </li></ol> 4. Uyarılma ve Kayıt <ol><li> Artık beyin ve kayıt yanıtları bacak ve uçuş kasları uyarıcı başlamak için hazırız. (Bilgisayar monitörü görüldüğü gibi, yani bir kas seğirme ve kas hücre depolarizasyon) bir yanıt gözlemlemek kadar 30 V ve 60 V artan uyarıcı elektrotlar arasında kısa bir uyaran (0.03 ms) uygulayın. Deney kalanı için, yanıt eşiğinin üzerinde gerilim 5-10 V ayarlayın. </li><li> Cevap gecikmesi ölçmek için, her bir uyaran arasında 5 saniyelik bir dinlenme süresi en az 5 tek uyaranlara verir. </li><li> Farklı hızlarda uyaranların trenler "aşağıdaki frekans" belirleyin. Genellikle 10 trenler 10 uyaranlara 200Hz (her uyaran arasındaki 5ms) ve 300Hz (3ms arasında her uyaran) 100Hz (her uyaran arasındaki 10ms) verilmiştir. Uyaranların her tren arasında 2 saniyelik bir dinlenme süresi izin verin. </li></ol> 5. Sonuçlar: Dev Fiber Pathway ardından Tepkisi Gecikme ve Frekans <ol><li> Yanıt gecikme beyin uyarımı ve kas depolarizasyon arasındaki zaman. Bu rakam tek bir uyarana yanıt latans DLM ve TTM karşılaştırır. Gecikme, 0.7 ve 1.2 ms GF-TTM yolun ve GF-DLM yol için 1.3 ve 1.7 ms arasında arasında sağlıklı bir hazırlık ve uygun kayıt tekniği göstermektedir. Gecikmeleri genotip, genetik arka plan, sıcaklık ve yaşa göre değişir. Şekil 1 (A ve B). Temsilcisi beyne uygulanan tek bir uyarıcı TTMs ve DLMS kaydedilen tepkiler gösteren izler. </li><li> Burada gösterildiği gibi, TTM kayıtları genlik ve büyük DLM liflerinden göre postsinaptik potansiyel (PSP) şekil açısından daha fazla değişkenlik göstermektedir; bu artan değişkenlik TTM kas lifleri küçük boyutu nedeniyle. Ancak, bu değişkenliği, Dev Fiber-to-TTM yolun yanıt latans değerleri etkiler değildir. Şekil 1 (C ve D) daha fazla 'tepki gecikme' TTM ve DLM hem de 4 ayrı sinekler izler. Not PSP şeklinde TTM izleri sergi değişkenlik ama cevap gecikmesi etkilenmez. DLM için PSP şekli daha az değişkenlik yoktur. <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig1.jpg" alt="Şekil 1 A-D" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1 A-D"> </li><li> Her stimülasyon frekansta DLM ve TTM yollar hem de başarılı yanıtlar (10) oranı hesaplanarak, 100 Hz, 200 Hz ve 300 Hz "aşağıdaki frekans" karşılaştırın. 100 Hz, hem TTM ve DLM uyaranlara 01:01 izleyin. Iki internöronlar arasında aracılık kimyasal sinaps uyaranlar arasında kurtarmak için yeterli zaman olmadığı için, yukarıda stimülasyon frekansları 100 Hz DLM yanıtları hataları göstermeye başlar. TTM tepkiler, ancak, 1:1 300Hz ötesinde bile uyaranlara kalır. Şekil 2 "aşağıdaki frekans" kayıtları gösteren Temsilcisi izleri. 100Hz, her iki TTMs ve DLMS Tüm 10 (solda) uyaranlara yanıt verir. 200Hz, DLM yanıtlar (yıldız) başarısız başlar. <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> </li></ol>6. Temsilcisi Sonuçlar Vahşi tip kısa gecikmeli yanıtlar (uyarılan elektrotlar duyu reseptörleri atlayarak doğrudan GF devre tetikleme, gözler yerleştirilir) GF-TTM yol için 0.7 ve 1.2 ms arasında genotip, genetik arka plan, sıcaklık ve yaş ve aralık bağlıdır and1.7 GF-DLM yolak 1.3 ms (Tanouye ve Wyman, 1980; Thomas ve Wyman, 1984; Engel ve Wu, 1992; Allen ve Murphey, 2007; Phelan ve ark, 2008; Augustin ve ark, yayınlanmamış.) . Bu çok kısa TTM gecikme monosinaptik yol ve uzun DLM gecikme sağlam GF-TTMN elektrokimyasal sinaps nedeniyle yolun disynaptic doğanın yanı sıra bir kimyasal sinaps (PSI DLMn) varlığı nedeniyle oluşur. Orta ve uzun gecikmeli tepkiler GF afferentlerin aktivasyonu ve daha düşük bir yoğunluğu stimülasyon kullanarak ya da görsel ("ışık-off") sinyal sağlayarak elde edilir (&gt; 3 ms) sonucu. 100Hz TTM ve DLM uyaranlara 01:01 takip etmelidir. 100Hz şeyden DLM yanıtları PSI ve DLMns arasındaki kimyasal sinaps dışında 10ms az uyaranlara arasında kurtarmak için yeterli zamana sahip değildir hatalarını göstermeye başlayacaktır. Ancak, TTM tepkiler bile 300Hz (Engel ve Wu, 1992; Allen ve ark, 2007; Martinez ve ark, 2007 Tanouye ve Wyman, 1980) ötesinde uyaranlara 1:1 kalacaktır. GF-DLM şube tepkisiz bir Drosophila gap junction kanal kodlama ("innexin") shakB genindeki mutasyonlar, GF-TTM yolak (~ 1.5 ms) tepki gecikme önemli ölçüde artış (Allen ve Murphey, 2007; Phelan ve ark, 2008). Mutant yanıt kesintiye nöromüsküler iletim nedeniyle gecikmeli etkisi olduğunu gösteren, torasik ganglionlar doğrudan uyararak restore edilebilir. Yüksek frekanslı stimülasyon takip yeteneği de vahşi tip GF-DLM ve GF-TTM yollar genellikle sırasıyla 100 Hz ve 300 Hz, 1:1 oranına sahip 10 uyaranlara takip edebiliyoruz uçar göre bu mutant bozulur. Bu frekansları sözleşme kasları sürekli uçuş (3-10 Hz) (Hummon ve Costello, 1989) sırasında alınan normal stimülasyon frekansları oldukça üstünde olduğunu not etmek önemlidir. GFS çıkışları istikrarı tanımlamak için kullanılan bir başka parametre "refrakter dönem", ya da hala kas iki cevap üretir ikiz uyaran bakliyat arasındaki minimum süre. Refrakter TTMs ve DLMS için 7-15 ms ms 1-4 arasında değişir. DLMS için nispeten uzun bir refrakter dönem nispeten PSI DLMn kavşağı (Tanouye ve Wyman, 1980 kimyasal sinaps labil nedeniyle; Gorczyca ve Hall, 1984; Engel ve Wu, 1992; Banerjee ve ark, 2004; Allen ve Godenschwege 2010).

<ol><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllen%2C+MJ+%22Drosophila+Neurobiology%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual</a>. Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. , 1st Lab ed, Cold Spring Harbor Press. (2010).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).</li>
<li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).</li>
<li>Banerjee, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+flight+and+associated+neuronal+rhythmicity+in+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila.</a> J Neurosci. 24, 7869-7878 (2004).</li>
<li>Engel, J. E., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+membrane+excitability+mutations+affecting+potassium+and+sodium+currents+in+the+flight+and+giant+fiber+escape+systems+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila.</a> J Comp Physiol A. 171, 93-104 (1992).</li>
<li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li>
<li>Hummon, M. R., Costello, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+fiber+activation+of+flight+muscles+in+Drosophila%3A+asynchrony+in+latency+of+wing+depressor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Giant fiber activation of flight muscles in Drosophila: asynchrony in latency of wing depressor fibers.</a> J Neurobiol. 20, 593-602 (1989).</li>
<li>Jacobs, K., Todman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+in+the+giant-fibre+system+of+Drosophila%3A+interaction+of+the+giant+fibre+and+its+major+motorneuronal+target%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis in the giant-fibre system of Drosophila: interaction of the giant fibre and its major motorneuronal target.</a> Development. 127, 5203-5212 (2000).</li>
<li>King, D. G., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+giant+fibre+pathway+in+Drosophila.+I.+Three+thoracic+components+of+the+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the giant fibre pathway in Drosophila. I. Three thoracic components of the pathway.</a> J Neurocytol. 9, 753-770 (1980).</li>
<li>Martinez, V. G., Javadi, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+climbing+behavior+and+neural+circuit+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in climbing behavior and neural circuit physiology in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 67, 778-791 (2007).</li>
<li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , 2nd, Hafner. New York. 502-503 (1965).</li>
<li>Phelan, P., Goulding, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+rectification+at+identified+electrical+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system.</a> Curr Biol. 18, 1955-1960 (2008).</li>
<li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect%2C+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 88, 347-409 (1948).</li>
<li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> J Neurophysiol. 44, 405-421 (1980).</li>
<li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li>
</ol>

Biri yüksek kaliteli kayıtlar elde etmek için çalışırken dikkat etmek en önemli şeylerden biri hazırlanması doğru yönelim ve sağlık. İdeal olarak, sinek hala elektrik uyaranlara duyarlı kayıt oturumunun sonunda hayatta olması gerekir. Kayıt elektrotları en verimli şekilde torasik Exoskeleton nüfuz elektrotlar ile dik açı oluşturacak şekilde, sinek şekilde yüzeye yapıştırılmış olmalı, gerekirse, elektrot yerleştirme, bir kısmını kaldırarak kolaylaştırılabilir tungsten neşter ile birlikte dorsal torasik manikür böylece açığa DLM uçuş kası (bu adım cam elektrot uçları kırmak için zor karar ek bir avantaj sunuyor). Ayrıca, bakım subcuticularly bulunan DLMS ve TTMs aracılığıyla elektrotlar iterek önlemek için alınmalıdır. Sineğin baş ve beyin düzgün eklenecek uyarıcı elektrotlar için izin vermek ve onları kayıt oturumu sırasında çıkardı önlemek için güvence altına alınmalıdır. Büyüklüğü ve iyi tanımlanmış morfolojisi nedeniyle, GFS Drosophila en kolay nöronal yolların birini temsil eder. Nöronların elektriksel birleştiğinde görünüm için küçük bir molekül ağırlığı tracer boyalar elektrik sinaps geçirgenliği sağlar ve birçok kullanılabilir GAL4 hatları mümkün gen ekspresyon düzeyleri, hücre ya da hücre grupları (Jacobs ve ark, 2000 bir alt kümesi işlemek için; . Allen ve ark, 2006) Drosophila GDS nöronal plastisite eğitim için uygun bir model sistem (Engel ve Wu yukarıda belirtilen avantajları, hem afferent ve torasik bileşenler, alışkanlık, spontan iyileşme ve dishabituation olarak devre görüntü özellikleri, ek olarak, 1996).

<table border="1"><tbody><tr><td> ADI </td><td> ŞİRKET </td><td> CAT. # </td><td> YORUMLAR </td></tr><tr><td> S48 Meydanı Darbe Stimülatör </td><td> Çim Aletleri </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> Uyarım birim </td><td> Çim Aletleri </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> SIU5 RF Trafo İzolasyon Birimi </td><td> Çim Aletleri </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> 5A iki kanallı intrasellüler Mikroelektrod Amplifikatör </td><td> Araçların Başlarken </td><td></td><td> http://www.gettinginstruments.com/ </td></tr><tr><td> Digidata 1440A veri toplama sistemi </td><td> Moleküler Cihazlar </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Analog-Dijital Digidata 1320 ve Axoscope 9.0 yazılımı </td><td> Moleküler Cihazlar </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Manuel mikromanipülatörler kayıt platformu </td><td> Narishige, Sutter Ins, Dünya Hassas Ins. </td><td></td><td> http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Işık kaynağı </td><td> Fostec </td><td></td><td> http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm </td></tr><tr><td> Vahşi M5 stereomikroskopta </td><td> Wild Heerbrugg </td><td></td><td> http://www.wild-heerbrugg.com/ </td></tr><tr><td> Titreşim izolasyonu tablosu </td><td> TMC </td><td></td><td> http://www.techmfg.com/ </td></tr><tr><td> Mikroelektronlar için borosilikat tüp </td><td> Sutter Enstrüman </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> P-95 Mikropipet çektirmesi </td><td> Sutter Enstrüman </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> Microfil 34 gauge, 67 mm (elektrot dolgu) </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> MF34G-5 </td><td> http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Mikrodisseksiyon araçları (forseps, ...) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td></td><td> www.finescience.com </td></tr><tr><td> Diseksiyon (stereo) mikroskop </td><td> Leica </td><td></td><td> http://www.leica-microsystems.com/ </td></tr><tr><td> Faraday kafesi </td><td> Bilinmeyen üretici </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Diğer: plastik şırıngalar, tungsten toprak teli ve NaOH bilenmiş tungsten elektrotlar, KCl, mum platform, bir PC monitörü ile ...

dev fiber pathway elektrofizyolojik kayıtlar d. melanogaster</em

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Yetişkin ürküyor zaman D. melanogaster atlama ve havaya uçup tepki. D. de dahil olmak üzere pek çok omurgasız türleri , melanogaster yetişkin aşamasında, &quot;kaçış&quot; (veya &quot;irkilme&quot;) yanıt çok bileşenli nöronal devre Dev Fiber Sistemi (GDS) olarak adlandırılan aracılık eder . Nöronlar, kendi ayırt edici morfolojisi ve basit bağlantı karşılaştırmalı büyük boy GFS nöronal devre eğitimi için cazip bir model sistem olun. GFS yolu aksonlar servikal bağ üzerinden torasik ganglion içine orta hat boyunca beyin soyundan olan bilateral simetrik iki Giant Fiber (GF) internöronlar oluşmaktadır. Mesothoracic neuromere ventral ganglionlar 1) ipsilateral motorneuron tergotrochanteral kas sürücüler büyük medial dendrit (TTMN) (TTM), ana mesothoracic femur / bacak ekstansör GF&#39;lerin formu elektro-kimyasal sinaps (T2) , ve 2) kontralateral periferik synapsing interneuron (PSI) dönüş formları dorsal longitudinal kasları (DLMS) motorneurons (DLMns), kanat depressors kimyasal (kolinerjik) sinapsların. Kanatları doğrudan bağlı değil, hareket değildir dorsovental kasları (DVMs) nöronal yolağı (ler), kanat asansör, henüz (DLMS ve DVMs dolaylı uçuş kaslarının ortaklaşa bilinen çalışmış değil dolaylı olarak yakındaki torasik manikür bozan kanat) (King ve Wyman, 1980, Allen ve ark, 2006). DLMS di-sinaptik aktivasyon TTMs ilk femur genişletmek ve itmek için izin TTM monosinaptik aktivasyonu (~ 0.5 ms) göre, bu kasların kasılma zamanlaması (PSI yoluyla) küçük ama önemli bir gecikmeye neden olur yerden uçarlar. Aynı anda da karşılıklı uçuş süresi DVMs streç etkinleştirmek DLMS streç etkinleştirmek TTMs. GF yolu duyusal (örneğin &quot;air-puf&quot; ya da &quot;yanar-off&quot;) uyaran uygulanarak ya da dolaylı olarak aktif ya da doğrudan beyin burada açıklanan üstü bir eşik elektriksel uyaran olabilir. TTMns ve DLMns, henüz tanımlanmamış, diğer duyusal girdilerin var ancak her iki durumda da, bir aksiyon potansiyeli, sadece GF&#39;lerin, PSIs ve TTM / DLM motor nöronlar aracılığıyla TTMs ve DLMS ulaşır. &quot;Gecikme tepkisi&quot; (uyarımı ve kas depolarizasyon arasındaki zaman) ve Ölçme &quot;yüksek frekanslı stimülasyon için aşağıdaki&quot; (yüksek frekanslı uyaranlar belli bir sayıda başarılı yanıtlarının sayısı), tekrarlanabilir ve kantitatif fonksiyonel durumu değerlendirmek için bir yol sağlar GFS bileşenleri, hem merkezi sinaps (GF-TTMN, GF-PSI, PSI DLMn) ve kimyasal (glutamaterjik) nöromüsküler kavşaklar (TTMN-TTM ve DLMn-DLM) de dahil olmak üzere. Bu, merkezi sinaps oluşumu ilgili genler tespit ve merkezi sinir sistemi fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır olmuştur.

Dev Fiber Sistemi yetişkin basit bir nöronal devre<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sinek en büyük nöron içeren. Biz bu yolun Dev Fiber internöronlar doğrudan uyarılmasını takiben dorsal longitudinal (DLM) ve tergotrochanteral (TTM) kaslar post sinaptik potansiyeller kayıt yoluyla sinaptik iletim izlemek için protokol açıklar.

Dev Fiber Pathway Elektrofizyolojik Kayıtlar D. melanogaster</em

Yetişkin D. melanogaster bireyleri, irkildiklerinde havaya sıçrayarak ve uçarak uzaklaşarak tepki verirler. D. melanogaster dahil olmak üzere birçok omurgasız türünde, "kaçış" ...

Bu prosedürün genel amacı, dev fiber nöronlarının doğrudan stimülasyonunun ardından dorsal longitudinal kasından (DLM) ve Togo tro cantoral kasından (TTM) post-sinaptik potansiyeller kaydederek, dev fiber yolu üzerinden sinaptik iletimi izlemektir. Bu işlem, öncelikle anestezi uygulanmış bir sineğin, bir miktar balmumu içeren bir kaba uygun şekilde sabitlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, stimülasyon, toprak ve kayıt elektrotlarının sineğe yerleştirilmesidir.Prosedürün son adımı, beyni uyarmak ve sıçrama ile uçuş kaslarından yanıtları kaydetmektir. Sonuç olarak; genotip, yaş, sıcaklık ve benzeri değişkenlerin bir fonksiyonu olarak dev fiber yolunun fonksiyonel özelliklerindeki değişiklikleri gösteren veriler elde edilebilir. Bu işlem, uyaran ile yanıt arasındaki sürenin kaydedilmesi ve yüksek frekanslı bir uyaran dizisini takiben gerçekleşen başarılı yanıt sayısının sayılmasıyla gerçekleştirilir.Bu yöntem, nörofizyoloji alanındaki bazı temel soruların yanıtlanmasına katkı sağlayabilir ve nöronal yolakların fonksiyonel özelliklerinin incelenmesine yardımcı olabilir. Bu teknik, ya ardından genetik veya moleküler analizlerin geldiği bir giriş deneyi olarak ya da bilinen bir mutasyonu taşıyan hayvanlardaki fizyolojik ve fonksiyonel özelliklerin değerlendirilme yolu olarak uygulanabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.Sinekler nispeten küçük oldukları için hazırlık ve etkisiz hale getirme adımlarının öğrenilmesi biraz zaman almaktadır; deneylerin doğru şekilde gerçekleştirilebilmesi için belirli bir düzeyde sabitlik ve koordinasyonun kazanılması gerekir. Bu deneylerde; bir stimülatör, bir stimulus izolasyon ünitesi, iki mikro elektrot amplifikatörü, bir veri toplama sistemi ve toplama yazılımına sahip bir bilgisayardan oluşan standart bir elektrofizyoloji düzeneği kullanılır.Ekipmanlar arasında bir Faraday kafesi, bom destekli bir stereo mikroskop, bir titreşim izolasyon masası, bir ışık kaynağı ve bir kayıt platformu yer almaktadır. Beş adet mikro manipülatör kullanılır. İki mikro manipülatör, kayıt elektrotlarını konumlandırmak için hassas kontrollere ihtiyaç duyarken, diğer üç mikro manipülatör yalnızca kaba kontrollere ihtiyaç duyar.İki stimülasyon elektrodunu ve toprak elektrodunu konumlandırmak için, DLM kayıt elektrodunun manipülatörü preparasyonun kuyruk ucuna yerleştirilir. TTM kayıt elektrodu için olan mikro manipülatör, deneyci ile preparasyonun yan tarafı arasına yerleştirilir. Stimülasyon elektrodları için kullanılan iki mikro manipülatör ise preparasyonun baş kısmına yerleştirilir.Toprak elektrodu için kullanılan mikro manipülatör, hazırlığın uzak tarafına yerleştirilir. 40 ila 60 mega ohm dirençli cam kayıt mikro elektrotları çekilir ve balmumu ile desteklenmiş bir kapta düz bir şekilde saklanır. Stimülasyon için elektromanyetik olarak sivriltilmiş iki tungsten elektrot kullanılır.Bir gövde teli veya elektromanyetik olarak üretilmiş üçüncü bir elektrot kullanın. Topraklama olarak, uyarıcı ve toprak elektrotlarını deneysel oturum başlamadan önce mikromanipülatörlere sabitleyin. Oturum süresince bunların değiştirilmesine gerek olmayacaktır.Ekipmanınız kurulduktan sonra, sinekleri hazırlama zamanı gelmiştir. Sinekleri 10 ila 15 dakika boyunca buz üzerinde soğutarak anestezi altına alın. Pens kullanarak sineği bacaklarından nazikçe kavrayın ve yaklaşık 45 derecelik bir açıyla eğimli, yumuşak balmumu platformu içeren bir kaba aktarın.Bir sonraki adım, sineği balmumuna sabitlemektir. Sineği, ventral tarafı aşağıya gelecek ve ön kısmı eğimin yukarıya doğru bakacak şekilde konumlandırın. İnce uçlu bir pens kullanarak, bacakları çiftler halinde dışa doğru açın ve balmumuna itin.Bu deneye başlamadan önce, kayıt alınacak kasların konumlarına; dorsal longitudinal kas (DLM) ve turga TRO kantoral kasına (TTM) aşina olduğunuzda, DLM'lerin subkutiküler tutunma bölgelerinin torasik orta hat ile anterior dorsal kıllar arasındaki bölgeye karşılık geldiğini göreceksiniz. TTM tutunma bölgeleri, posterior ve anterior supra alar kılların dorsal kısmında yer alır; kanatların DLM veya TTM liflerine erişimi engellemediğinden emin olmak için kanatları dışarı doğru tutun ve balmumuna yapıştırın. Bir çift ince pens kullanarak, psis'i dikkatlice dışarı çekin ve balmumuna daldırarak sabitleyin.Probosis yumuşak olduğu ve başın geri kalanından kolayca ayrıldığı için bu adım, biraz pratik gerektiren kritik bir aşamadır. Eğer bu durum gerçekleşirse, sineği atın ve işlemi yeniden başlatın. Başın bu şekilde sabitlenememesi, uyarıcı elektrotların gözlerden geçirilmesi sırasında sorunlara yol açar.Sinek bala sabitlendikten sonra, hazırlığı stereo mikroskop altına yerleştirin. Faraday kafesinin içinde, sineği yan şekilde, başı deneycin sağına gelecek şekilde konumlandırın. Bir sonraki adım elektrotların yerleştirilmesidir. Doğru yerleşimi ve sonraki kayıtları kolaylaştırmak için mikro manipülatörlerin yardımıyla elektrotları yerleştirme bölgelerine yaklaştırın; mikroskoptan bakmadan, mikro manipülatör üzerindeki ayar tekerleklerini kullanarak toprak elektrodunu abdomenin arka ucuna indirin ve sivriltilmiş tungsten stimülasyon elektrotlarını beyne yerleştirin.Elektrotlardan birinin ucunu, sineğin gözlerinden birine sadece değecek şekilde konumlandırmak için mikro manipülatörü kullanın. Aynı işlemi diğer elektrotla da tekrarlayarak, her iki elektrodun da her bir gözün dış yüzeyine hafifçe değmesini sağlayın. Ardından elektrotları içeri itin.Elektrot uçlarının baş kapsülünün arkasında yer alan beyne ulaşması için her bir göz üzerinden yaklaşık iki ila üç milimetre döndürme işlemi yapın. Doğru yerleştirilmiş elektrotlar, uyarıcı elektrotların doğru konumlandırıldığını test etmek için dev fiber sistemini aktive edecektir. Uyarıcı elektrotlar üzerinden 30 ila 60 voltluk kısa bir stimulus uygulayın ve kanat hareketlerini veya uçuş ya da bacak kaslarındaki seğirmeleri gözlemleyin.Bir sonraki adım, cam mikro elektrotları üç molar potasyum klorür ile bir Hamilton veya ısı ile çekilmiş plastik şırınga kullanarak geri doldurmak ve bunları hassas kontrol mikro manipülatörlerine yerleştirmektir. Doğru şekilde yerleştirilen mikro elektrotlar, birkaç deney turu boyunca kullanılabilir. İlk kayıt elektrodu bir DLM lifine yerleştirilecektir.Bilateral simetriye sahip iki adet dlms bulunur. Her biri altı adet ayrı kas lifinden oluşur. Kayıtlar altı lifin herhangi birinden yapılabilir; ancak, toraks kütikülünün dorsal tarafı üzerinden erişimin kolay olması ve her iki lifin de aynı motor nöron tarafından innerve edilmesi nedeniyle, en yaygın kullanılanlar DLM lifleri 45 A ve 45 B'dir.Hazırlık yerleştiricinin kuyruk kısmına yerleştirilmiş olan mikro manipülatörü kullanarak, kayıt elektrodunu sineğin en uzak tarafındaki DLM fiber 45 A veya B'ye yerleştirin. Platformun eğimi, DLM elektrodunun dorsal kütiküle 60 ila 90 derecelik bir açıyla girmesine olanak tanır ve osiloskop modundaki yazılım kullanılarak penetrasyonu kolaylaştırır. Kayıt elektrodunu toraksa yerleştirirken bilgisayar monitörünü izleyin.Elektrot bir kasa girdiğinde, baz çizgisi sıfıra yakın veya negatif bir değere düşer; kas yanıtını gözlemleyebilmek için tek bir stimülasyonla test edin. Diğer kayıt elektrodunu, sineğin size en yakın tarafındaki TTM'ye yerleştirin. Kas tutunma bölgesinin konumu nedeniyle bu elektrot, ön tarafınızdan lateral olarak yerleştirilir.Bu işlemi gerçekleştirirken monitörü tekrar gözlemleyin. İz, elektrodun kas içinde olduğunu gösterdiğinde, kas tepkisi oluşturmak için tek bir stimulus uygulayın. Beyni stimüle etmeye ve bacak ile uçuş kaslarından tepkileri kaydetmeye başlamak için, stimülasyon elektrotları üzerinden, 30 volt ile başlayıp bilgisayar monitöründe bir kas seğirmesi ve bir kas hücresi depolarizasyonu gözlemleyene kadar 60 volta yükselen 0.03 milisaniyelik bir stimulus uygulayın.Deneyin geri kalanı için voltajı, yanıt eşiğinin 5 ila 10 volt üzerine ayarlayın. Yanıt gecikmesini ölçmek için, her stimülasyon arasında beş saniyelik bir dinlenme süresi olacak şekilde en az beş tekil stimülasyon uygulayın.Farklı hızlarda stimülasyon trenleri sağlayarak takip eden frekansı belirleyin. Tipik olarak, 100 hertz, 200 hertz ve 300 hertz hızlarında, her biri 10 stimülasyondan oluşan 10 tren verilir ve her stimülasyon treni arasında iki saniyelik bir dinlenme süresi bırakılır. Bu şekil, beyne uygulanan tek bir stimülasyonun ardından TTM'ler ve dlms'lerden kaydedilen yanıtları göstermektedir.Yanıt latansı, beynin uyarılması ile kasın depolarizasyonu arasındaki süredir. G-F-T-T-M yolu için 0,7 ile 1,2 milisaniye, GF DLM yolu için ise 1,2 ile 1,7 milisaniye arasındaki latans değerleri, sağlıklı bir preparasyonun ve uygun kayıt tekniğinin göstergesidir. Latanslar, burada gösterildiği gibi genotipe, genetik arka plana, sıcaklığa ve yaşa bağlı olarak değişiklik gösterebilir.TTM'den alınan kayıtlar, büyük DLM liflerinden alınanlara kıyasla post-sinaptik potansiyelin genliği ve şekli açısından daha fazla değişkenlik göstermektedir. Bu artmış değişkenlik, TTM kas liflerinin küçük boyutundan kaynaklanmaktadır. Ancak bu değişkenlik, dev liften TTM'ye uzanan yolak için yanıt latans değerlerini etkilememektedir.Bu şekil, 100 hertz ve 200 hertz frekanslardaki TTM ve DLM stimülasyonunu göstermektedir. Hem TTM'ler hem de DLM'ler 200 hertz'deki tüm 10 stimülüse yanıt verir. TTM yanıtları bire bir kalırken, DLM yanıtları başarısız olmaya başlar.DLM'nin 100 hertz üzerindeki stimülasyon frekanslarını takip edememesinin nedeni, iki inter nöron arasındaki ara kimyasal sinapsın stimülasyonlar arasında toparlanmak için yeterli zamana sahip olmamasıdır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik yaklaşık 30 dakikada tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, dev fiber yolu üzerinden nörotransmisyonun nasıl izleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu işlem, beyindeki nöronların içine giren dev lifin uyarılması ve ardından torakstaki bir sıçrama kası ile uçuş kaslarından kayıt alınmasıyla gerçekleştirilir.

electrophysiological-recordings-from-giant-fiber-pathway-d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada Drosophila larva nöromüsküler kavşakta sinaptik iletim ölçmek için elektrofizyolojik yöntemler açıklanmaktadır. Uyarılmış serbest motor nöron aksonları uyararak yapay olarak başlatılan ve iletim yoluyla NMJ kas uyarılmış postsinaptik tepki ölçülebilir.

Drosophila Larva NMJ Synaptic Potansiyeller kayıt için Elektrofizyolojik Yöntemler

Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Yetişkin Tüm Dağı Hazırlık Drosophila Dev Fiber Boya Enjeksiyon Ventral Sinir Kablosu

Kullanarak Bileşiklerin Biyoaktivite için eşli Nanoinjection ve Ekran için Elektrofizyoloji Testi Drosophila melanogaster Dev Elyaf Sistemi

Video, Drosophila larvalarının merkezi sinir sisteminden (CNS) nöronal aktivitenin hücre dışı kaydını göstermektedir. Kesilen CNS, bir kayıt odasına yerleştirilir ve temel ateşleme frekansını oluşturmak için inen bir sinirden gelen elektriksel aktivite kaydedilir. Daha sonra bir test ajanı eklenir ve ajanın uyarıcı veya inhibitör etkisini belirlemek için ateşleme frekansındaki değişiklik kaydedilir.

Drosophila Merkezi Sinir Sisteminde Elektriksel Aktivitenin Hücre Dışı Kaydı

Bu protokol Drosophila labellar tat nöronlar tarafından ateş aksiyon potansiyel yanıtları hücre dışı kayıt açıklar.

Elektrofizyolojik Kayıt<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Sensilla Taste

Keskin mikroelektrotlar, canlı Drosophila'da fotoreseptörün ve görsel internöron çıkışının doğru elektrofizyolojik karakterizasyonunu sağlar. Burada, tek tek hücrelerin kontrollü ışık stimülasyonuna yüksek kaliteli voltaj tepkilerini kaydetmek için bu yöntemin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu yöntem, böcek bileşik gözlerinde nöral bilgi işlemeyi incelemek için idealdir.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Sinaptik akımları, Drosophila Üçüncü INSTAR larva nöromüsküler kavşak görüntülenmeyecektir sinaptik boutons üzerinden focally kaydedilebilir. Bu teknik, tek bir sinaptik bouton etkinliğini izleme sağlar.

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Bu iletişim kuralı maliyet-etkin ve uygun farmakolojik ajanları, sinirsel proteinlerin genetik mutasyonlar test etkinleştirmek için Drosophila melanogaster merkezi sinir sistemi azalan elektriksel aktivitesinin kaydetmek için bir yöntem açıklar, ve/veya keşfedilmemiş fizyolojik yolları rolü.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

Bu protokol, sağlam Drosophila larvalarında bireysel nöronların lazer hücresi ablasyonunu gösterir. Yöntem, gelişmekte olan sinir sistemindeki nöronlar arasındaki rekabeti azaltmanın etkisinin incelenmesini sağlar.

Sağlam Drosophila Larvalarında Lazer Hücre Ablasyonu Sinaptik Rekabeti Ortaya Çıkardı

Öğrenin, Drosophila melanogaster'da dev fiber yolunda sinaptik iletimi elektrofizyolojik kayıtlarla nasıl izleyeceğinizi. DLM ve TTM kaslarından postsinaptik potansiyeller ölçülerek nöron devrelerinin işlevsel özellikleri değerlendirilir.

Dev Fiber Pathway Elektrofizyolojik Kayıtlar D. melanogaster

Daha fazla video keşfet