Kolorimetrik Bir Test Kullanılarak Bakteriyel Membrana Bağlı Pirofosfataz İnhibitörlerinin Taranması

Bakteriyel membrana bağlı pirofosfataz veya mPPaz, sodyum iyonlarını membran boyunca pompalarken pirofosfatı ortofosfata hidrolize eder.

mPPazlara karşı inhibitör etkilerini değerlendirmek için, tüp şeritlerine artan konsantrasyonlarda fosfat standartları ekleyin.

mPPaz'ı inhibe edebilecek test bileşiklerini tüplere yerleştirin ve kontrol olarak su bırakın.

Termofilik bakteri Thermotoga maritima'dan türetilen lipozom gömülü mPPazları standartlar dışındaki tüm tüplere ekleyin.

Enzimi aktive etmek için kapatın ve en uygun sıcaklıkta inkübe edin.

Reaksiyonu başlatmak ve ortofosfatı serbest bırakmak için sodyum pirofosfat ekleyin.

Reaksiyonu durdurmak için tüpleri bir soğutma platformuna aktarın ve yoğuşmayı gidermek için santrifüjleyin.

Ortofosfat ile reaksiyona girmek ve fosfomolibdik asit oluşturmak için molibdat-askorbat reaktifini ekleyin.

Asidi azaltmak için arsenit-sitrat çözeltisini ekleyin ve stabil bir mavi kompleks oluşturun.

İçeriği çok kuyulu bir plakaya aktarın ve absorbansı ölçün.

Kontrole kıyasla daha düşük bir absorbans, mPPaz inhibisyonunu gösterirken, standartlar fosfat ölçümü için bir referans görevi görür.

10 mililitre A çözeltisine bir mililitre B çözeltisi ekleyin, elle kar