JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:15 dk • October 30th, 2025
Referans olarak uyuyan bakteri sporları ve floresan mikroküreler içeren bir slayt alın.
Sporlar, çimlenme proteinleri için kırmızı ve yeşil floresan raportörler taşır ve iç zar lipofilik bir boya kullanılarak boyanır.
Slaytı, yapılandırılmış bir aydınlatma mikroskobuna veya yağa daldırma objektifi ile donatılmış bir SIM'e monte edin.
Floresan mikroküreleri bulun ve görüntü bulanıklığını en aza indirmek için odağı ayarlayın.
Ardından, bakteri sporlarını bulmak için iletilen ışığı kullanın.
SIM moduna geçin ve floroforları uyarmak için sporları aydınlatın.
Spor derinliği boyunca yüksek çözünürlüklü floresan görüntüler elde edin.
Lipofilik boya lekeli iç zarda, çimlenme proteinleri belirgin kırmızı ve yeşil odaklar olarak görünür. Bu, bakteri sporları içindeki çimlenme proteinlerinin konumunun hassas bir şekilde haritalanmasını sağlar.
Numunelerin görüntülenmesi için, slaytı 100X yağ objektifi ile donatılmış yapılandırılmış bir aydınlatma mikroskobuna yerleştirin ve 100 nanometre floresan mikrokürelere odaklanın.
Görüntülerin bulanıklaşmasını en aza indirmek için simetrik bir nokta yayılma işlevi elde edilene kadar 100X objektif üzerindeki düzeltme halkasını ayarlayın ve yaklaşık 10 yuvarlak floresan mikroküre içeren bir görüş alanı seçin. İletim ışığıyla sporlara odaklanmadan önce, görüntü analiz yazılımı için bir kılavuz olarak, belirlenen uyarma dalga boyları (bu durumda 561 ve 488 nanometre) için bir ızgara odak ayarı uygulayın. Her görüntü için 20 milisaniyelik pozlama ile 16X ortalama modunda bir iletim ışığı görüntüsü yakalayın.
Ardından, 3D-SIM aydınlatma modu ile sporların 3D yapılı aydınlatma mikroskobu ham floresan görüntülerini yakalayın.