JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:04 dk • October 30th, 2025
Soğuk bir tamponda asılı duran vahşi tip Dictyostelium discoideum amip hücreleriyle başlayın.
Tampon, membran stabilitesini koruyan iyonik bir ortam sağlar.
Daha sonra, amip hücrelerini hedef gene sahip bir plazmit içeren bir tüpe ekleyin.
Plazmitleri amip yüzeyi ile yakın temas ettirmek için çözeltiyi yavaşça karıştırın.
Bu karışımı önceden soğutulmuş bir elektroporasyon küvetine aktarın ve elektroporasyon gerçekleştirin.
Elektroporasyon sırasında, elektrik darbeleri hücre zarında geçici gözenekler oluşturur.
Plazmit bu gözeneklerden sitoplazmaya girer ve daha sonra çekirdeğe yer değiştirir.
Daha sonra, amip hücrelerini, besleyici bakterilerle desteklenmiş sıvı bir ortam içeren bir Petri kabına aktarın.
Amip, bakterileri fagositoz yoluyla tüketerek hücre iyileşmesi için gerekli besinleri sağlar ve plazmit ekspresyonunu sağlar.
Besleyici bakteriler, bakteri olmadan büyüyen özel suşlara ihtiyaç duymadan vahşi tip amip hücrelerinde transfeksiyonu destekler.
Hücreleri H40 tamponunda yeniden askıya alın.
Daha sonra, bir ila iki mikrogram DNA içeren bir tüpe 100 mikrolitre hücre ekleyin. Hücre DNA karışımını karıştırmak ve önceden soğutulmuş bir elektroporasyon küvetine aktarmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
İki mikrogramdan fazla DNA eklemeyin. Daha yüksek DNA konsantrasyonu hücreler için toksiktir ve verimliliği azaltır.
Elektroporasyondan sonra, hücreleri hemen hazırlanmış 10 santimetrelik bir petri kabına aktarın ve hücrelerin beş saat boyunca iyileşmesine izin verin.