Negatif İyon Değişim Kromatografisi ile Bir Bakteriyel Proteinin Seçici Saflaştırılması

JoVE Encyclopedia of Experiments

Mikrobiyoloji

0 görüntüleme • 3:28 dk • October 30th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seçici protein bağlanması için pozitif yüklü fonksiyonel gruplar içeren bir iyon değiştirici reçine çözeltisi ile başlayın.

Daha sonra, patojenik bakteri Helicobacter pylori'den bir virülans faktörünü aşırı eksprese etmek üzere tasarlanmış konakçı bakteri hücrelerinden elde edilen bir protein özütü alın.

Ekstrakt, pH 8'de bir tamponda konakçı hücre proteinleri ile birlikte hedef virülans faktörünü içerir.

Protein ekstraktını reçine ile karıştırın ve homojen protein-reçine etkileşimini sağlamak için çalkalayarak inkübe edin.

Tampon pH'ından daha düşük izoelektrik noktalara sahip olan konakçı proteinler, negatif yüklü hale gelir ve pozitif yüklü reçineye bağlanır.

Tampon pH'ına yakın bir izoelektrik noktaya sahip olan hedef protein, büyük ölçüde yüksüz kalır ve bağlanmadan kalır.

Protein-reçine bulamacını bir kromatografi kolonuna aktarın ve reçinenin çökmesine izin verin.

Bağlanmamış hedef proteini içeren sıvı fazı toplayın.

Hedef proteinin maksimum geri kazanımını sağlamak için reçineyi tamponla durulayın.

15 mililitre DEAE reçinesi hazırlamak için, 0,6 gram DEAE reçinesi kuru tozunu oda sıcaklığında oda sıcaklığında 30 mililitre Tris-HCl tamponu içinde en az bir gün süspanse edin.

Reçineyi bir dakika boyunca dört santigrat derecede 10.000 kez g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın. Ardından 15 mililitre Tris-HCl tamponu ekleyin. Santrifüjlemeyi tekrarladıktan sonra, yeniden süspansiyon adımları dört kez daha, 15 mililitre çökelmiş reçineyi daha sonra kullanmak üzere dört santigrat derecede saklayın.

Dört santigrat derecede çalışarak, hazırlanan çözünür proteinlerden 45 mililitreyi 15 mililitre reçineye ekleyin ve karıştırma çubuklu 100 mililitrelik bir behere aktarın. Protein reçinesi bulamacını bir saat boyunca dört santigrat derecede bir karıştırma plakası kullanarak karıştırın. Daha sonra, protein reçinesi bulamacını, muslukla donatılmış plastik veya cam bir sütuna dökün ve reçinenin yerçekimi altında çökmesine izin verin.

Kolondaki sıvı seviyesi reçinenin hemen üzerine gelene kadar protein çözeltisinin yerçekimi akışıyla kolondan geçmesine izin vermek için musluğu açın. Akışı, saflaştırılmış nötrofil aktive edici proteini içeren bağlanmamış fraksiyon olarak toplayın. Kolona 15 mililitre buz gibi Tris-HCl tamponu ekleyin.

Yıkama tamponunun, kolondaki sıvı seviyesi reçinenin hemen üzerine gelene kadar yerçekimi akışıyla kolondan geçmesine izin vermek için vanayı tekrar açın. Akışı yıkama fraksiyonu olarak toplayın. Ek yıkama fraksiyonlarını toplamak için buz gibi soğuk tamponla yıkamayı dört kez daha tekrarlayın.

07:35

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması Cis -prenıltransferaz in Escherichia coli

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:27

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:14

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:32

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

İlgili videolar

0 Görüntüler

02:54

Rekombinant Bakteriyel Proteinin Arındırılması için Afinite Kromatografi Tekniği

İlgili videolar

0 Görüntüler

02:59

Anyon değişim kromatografisi bazlı protein saflaştırması: Net yüke dayalı olarak diyaliz edilmiş bakteri lizatından ilgilenilen bir proteini izole etmek için bir ayırma tekniği

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:54

Nikel Afinite Kromatografisi Bazlı Protein Saflaştırması: Polihistidin Etiketli Rekombinant Proteinleri Bakteriyel Hücre Lizatından Saflaştırmak İçin Bir Teknik

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:33

Katyon Değişim Kromatografisi: Net Yüzey Yüküne Dayalı Olarak Böcek Hücresi Lizatından Hedef Rekombinant Proteini İzole Etme Tekniği

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:03

Afinite Kromatografisi Kullanılarak Kendi Kendine Birleşen Protein Nanopartiküllerinin Saflaştırılması

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:44

Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma Helicobacter pylori Nötrofil-aktive protein aşın Escherichia coli Toplu Modunda

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 15 Ağustos 2026