Polihistidin Etiketli Bir Proteinin Streptococcus mutans'tan Saflaştırılması İçin Bir Prosedür

Ortama salgılanan polihistidin etiketli bir proteini eksprese eden bir Streptococcus mutans kültürünü ele alalım.

Kültürü santrifüjleyin ve protein açısından zengin süpernatanı toplayın.

Amonyum sülfat ekleyin ve proteinlerin çözünürlüklerini azaltarak çökeltmek için karıştırarak inkübe edin.

Çözeltiyi bir tüpe aktarın, santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Proteini stabilize etmek için peleti tuzlar ve düşük imidazol içeren bağlayıcı tamponda yeniden süspanse edin.

Fazla tuzları gidermek için çözeltiyi taze bağlama tamponuna karşı diyaliz edin.

Çözünmeyen kalıntıları pelet haline getirmek için diyalize edilmiş çözeltiyi santrifüjleyin, ardından süpernatanı filtreleyin.

Süzüntüyü nikel yüklü afinite reçinesi ile karıştırın ve polihistidin etiketli proteinin nikel iyonlarına seçici bağlanmasına izin vermek için inkübe edin.

Karışımı kromatografi kolonuna yükleyin ve bağlanmamış proteinleri çıkarmak için bağlayıcı tamponla yıkayın.

Daha sonra, histidini nikel iyonlarından uzaklaştırmak ve polihistidin etiketli proteini serbest bırakmak için yüksek imidazol içeren bir elüsyon tamponu ekleyin.

Saflaştırılmış proteinleri içeren bu elüatı toplayın.

Bakteri kültürü süspansiyonunu dört santigrat derecede 10.000 kez g'da 20 dakika santrifüjleyin.

Kültür süpernatanını üç litrelik bir cam behere aktarın. Kültür süpernatantından proteinleri konsantre etmek için, iki litrelik süpernatanı manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin ve kuvvetlice karıştırmaya başlayın. 1.122 gram amonyum sülfat ekleyin ve 4 saatlik bir süre boyunca veya gece boyunca dört santigrat derecede kuvvetlice karıştırarak çökeltinin oluşmasına izin verin.

Daha sonra, amonyum sülfat çökeltilmiş çözeltiyi 15.000 kez g'da 20 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın. Bir spatula ile çökeltiyi toplayın ve 200 mililitrelik bir cam behere aktarın.

Peletleri 35 mililitre bağlayıcı tamponda yeniden süspanse edin. Ardından, süspansiyonun yaklaşık 25 mililitresini rejenere bir selüloz diyaliz tüpüne aktarın. Süspansiyonu diyalize etmek için diyaliz tüpünü dört santigrat derecede bir karıştırıcı üzerindeki 2,5 litre karıştırma bağlama tamponuna yerleştirin.

Diyaliz solüsyonunu iki saat sonra değiştirin ve gece boyunca diyalize devam edin. Daha sonra, diyalize edilmiş süspansiyonu borudan santrifüj tüplerine aktarın ve tüpleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 20.000 kez g'da santrifüje yerleştirin. Emme filtrasyon ekipmanıyla, filtrelemek için süpernatanı 0,2 mikrometrelik bir membran filtrenin üzerine dökün.

Süzüntüyü 75 mililitrelik bir şişeye aktarın.

Polihistidin etiketli gtfSI'yi filtrelenmiş süspansiyondan fraksiyonlara ayırmak için önce hareketsizleştirilmiş bir metal afinite kromatografisi hazırlayın. Reçineyi el yazmasına göre dengeledikten sonra, Hoffman kıstırma musluğunu kapatın.

Bir bulamaç yapmak için kolona beş mililitre filtrelenmiş süspansiyon ekleyin. Ardından, tüm bulamacı kalan filtrelenmiş süspansiyona aktarın ve karışımı dört santigrat derecede 30 dakika boyunca hafifçe döndürün. Karışımı kolona geri yükleyin.

Süspansiyonu yerçekimi akışıyla çıkarmak için Hoffman kıstırma musluğunu açın. IMAC reçinesini 20 mililitre bağlayıcı tamponla yıkayın ve ardından rekombinant gtfSI'yi elde etmek için 20 mililitre elüsyon tamponunu ayrıştırın.