Tüberküloz Lezyonlarından Kazeuma İlaç Bağlanmasının Hızlı Denge Diyaliz Yöntemi ile Ölçülmesi

Tüberküloz lezyonlarından elde edilen ve özünde ilaca dayanıklı mikobakterileri barındıran nekrotik, lipit açısından zengin materyal olan kazeumun homojen bir süspansiyonunu alın.

Kazeum matrisi ile etkileşimini kolaylaştırmak için test ilacını homojenata ve girdaba ekleyin.

Taban plakasına yarı geçirgen bir zarla ayrılmış donör ve alıcı odalarını içeren hızlı bir denge diyalizi eki yerleştirin.

İlaç katkılı homojenatı donör odasına yükleyin ve alıcı odaya tampon ekleyin.

Plakayı kapatın ve döndürerek inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, serbest ilaç zar boyunca yayılır ve her iki oda arasında dengeye ulaşır.

Dengeye ulaşıldığında, ilaç miktar tayini için matris koşullarını normalleştirmek için donör numuneyi tamponla ve alıcı numuneyi ilaçsız homojenatla seyreltin.

Son olarak, ilaç konsantrasyonunu ölçün ve bağlanmamış ilaç fraksiyonunu veya fu'yu hesaplayın.

Fu, kazeuma yayılmak ve ilaca toleranslı mikobakterilere ulaşmak için mevcut olan serbest ilacı yansıtır.

Hazırlanan test bileşiğinin 6.5 mikrolitresini 643.5 mikrolitre homojenata ekleyin. Beş mikromolar ve girdabın nihai konsantrasyonunu elde etmek için.

Daha sonra kırmızı parçaları taban plakasına yerleştirin. Her test için ekleri hazırlayın, her bileşik üç kopya halinde.

Her kırmızı ekin kırmızı donör odasına 200 mikrolitre ilaç çivili matris ekleyin. Ardından, her alıcı hazneye 350 mikrolitre PBS ekleyin.

Plakanın üzerine yapışkan bir conta yerleştirin ve termal karıştırıcı üzerinde 37 santigrat derecede dakikada 200 devirde dört saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, donör ve alıcı odaların içeriğini iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın. Donör odalarının her birinden 20 mikrolitre homojenatı 1,5 mililitrelik bir tüpte 20 mikrolitre temiz PBS'ye aktarın.

Benzer şekilde, 20 mikrolitre PBS numunesi alikotunu alıcı odalardan 20 mikrolitre temiz homojenata aktarın.

Matris eşleştirme, kantitatif analiz için homojen ve PBS'de iki ayrı renk görme eğrisinin yapılması ihtiyacını ortadan kaldırır. Donör odasının içeriği zamanla çökelebilir. Alikotları çıkarmadan önce içeriği pipetleyerek yavaşça karıştırın.