Bakterilerde Antibiyotik Kalıcılığını İncelemek için Mikroakışkan Hızlandırılmış Mikroskopi

Nükleoidi görselleştirmek için floresan etiketli bir DNA bağlayıcı füzyon proteinini eksprese eden katlanarak büyüyen bakteri hücreleriyle başlayın.

Hücreleri önceden hazırlanmış bir mikroakışkan plakanın hücre girişlerine ekleyin.

Ardından, antibiyotik içeren besiyerleri ve antibiyotik içermeyen besiyerleri ayrı solüsyon girişlerine yerleştirin.

Plakayı kapatın, mikroskop aşamasına monte edin ve hızlandırılmış görüntülemeyi başlatın.

İlk olarak, hücreleri kültür odasına yükleyin.

Ardından, üstel hücre büyümesini desteklemek için antibiyotik içermeyen ortamı hazneye perfüze edin.

Son olarak, antibiyotik içeren ortamı tanıtın.

Antibiyotik, çift sarmallı DNA kırılmalarına neden olarak duyarlı hücreleri öldürür. Bu hücreler, stabil floresan ile sıkıştırılmış, replike olmayan nükleoidler sergiler.

İyileşmeyi desteklemek için antibiyotik içermeyen ortama geri dönün.

Kalıcı hücreler - antibiyotik tedavisinden kurtulan küçük bir alt popülasyon - DNA replikasyonunu sürdürür, uzar ve bölünür.

Bu iyileşme, kalıcı hücrelerde floresansın artmasına yol açarak, duyarlı hücrelerden görsel olarak ayırt edilmelerini sağlar.

Koruma solüsyonunu mikroakışkan plakanın her kuyucuğundan çıkarın ve taze kültür ortamıyla değiştirin. Mühürleme düğmesine tıklayarak veya mikroakışkan yazılım aracılığıyla mikroakışkan plakayı manifold sistemiyle kapatın.

Ardından, mikroakışkan yazılım arayüzünde, Sıvı Hazırlama Sırasını Çalıştır'a tıklayarak ilk hazırlama dizisini gerçekleştirin. Mikroskopi görüntülemeye başlamadan önce plakayı mikroskobun termostatik kontrollü bir kabininde 37 santigrat derecede en az iki saat inkübe edin. Ardından, deneye başlamadan önce ikinci bir Sıvı Hazırlama Sırası çalıştırın.

Mikroakışkan yazılım arayüzünde Plakayı Aç'a tıklayarak mikroakışkan plakayı kapatın. Kuyucuklardaki ortamı 200 mikrolitre taze ortam, antibiyotik içeren taze ortam ve taze ortamda 0.01 OD seyreltilmiş kültür numunesi ile değiştirin. Mikroakışkan plakayı daha önce gösterildiği gibi kapattıktan sonra, plakayı mikroskop kabininin içindeki mikroskop objektifine yerleştirin.

Mikroakışkan yazılımda, hücrelerin mikroakışkan plakaya yüklenmesine izin vermek için Hücre Yükleme Sırasını Çalıştır'a tıklayın. İletilen ışık modunu kullanarak en uygun odağı ayarlayın ve alan başına 300 hücreye kadar uygun hücre sayısının gözlemlenebileceği birkaç ilgi alanı seçin. Mikroakışkan yazılımda, 6.9 kilopaskalda taze ortamın altı saat boyunca birinci ve ikinci kuyucuklara, ardından 6.9 kilopaskalda antibiyotik içeren ortamın altı saat boyunca üçüncü kuyuya ve son olarak 6.9 kilopaskalda taze ortamın 24 saat boyunca dördüncü ve beşinci kuyulara enjeksiyonunu programlamak için Özel Bir Dizi Çalıştır'ı düzenleyin.

İletilen ışığı ve floresan raportör için uyarma ışık kaynağını kullanarak her 15 dakikada bir kare ile hızlandırılmış modda mikroskopi görüntüleme gerçekleştirin ve mikroakışkan programı başlatın. Bilgisayarda ImageJ veya Fiji yazılımını açın ve hiper yığın hızlandırılmış mikroskopi görüntülerini Fiji yükleme çubuğuna sürükleyin. Görüntü'yü, ardından Renk'i ve ardından Bileşik Yap'ı kullanarak hiper yığının farklı kanallarını birleştirin.

Kullan Görüntü, Renk, ve sonra Kanalları Düzenle kanallar istenen renge karşılık gelmiyorsa. MicrobeJ eklentisini açın ve manuel düzenleme arayüzünü kullanarak bakteri hücrelerini tespit edin. Otomatik olarak algılanan hücreleri silin ve ilgilenilen kalıcı hücreleri kare kare manuel olarak ana hatlarıyla belirtin.

Algılamadan sonra, bir ResultJ tablosu oluşturmak için MicrobeJ manuel düzenleme arayüzündeki Sonuç simgesini kullanın. Tek hücreli analizin ilgilendiği farklı parametreler hakkında bilgi edinmek için ResultJ tablosunu kullanın ve ResultJ dosyasını kaydedin.