Bir Floresan Raportör Proteini Eksprese Eden Bakteriler Kullanılarak Siklik di-GMP Modülatörlerinin Taranması

Negatif kontrollerle birlikte farklı test bileşikleri ile yetiştirilen genetiği değiştirilmiş patojenik bakterileri içeren çok kuyulu bir plaka alın.

Bakteriler, yeşil floresan proteini veya GFP'yi kodlayan bir gene sahip bir plazmit taşır.

Genin promotörü, hücre içi siklik di-GMP veya c-di-GMP konsantrasyonlarına yanıt veren bir protein tarafından aktive edilir.

Plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin.

Optimum floresan sinyal ölçümü ayarlarını yapmak için bir c-di-GMP inhibitörünün olmaması nedeniyle maksimum floresan veren negatif kontrolü kullanın.

Bir test bileşiği c-di-GMP oluşumunu inhibe ederse, hücre içi c-di-GMP seviyesi düşer.

Azalan c-di-GMP seviyeleri, proteinde konformasyonel bir değişikliği tetikleyerek promotörün baskılanmasına ve düşük GFP ekspresyonuna yol açar, bu da floresansın azalmasına neden olur.

Floresansı ölçün ve patojenik bakterilerde hücre içi c-di-GMP seviyelerini modüle eden test bileşiklerini belirlemek için verileri analiz edin.

Spektrofotometrik ölçümden yaklaşık 30 dakika önce, yoğuşmayı önlemek için plaka okuyucuyu 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Okumadan önce hava geçirgen kapak contasını plakadan yavaşça çıkarın.

Ardından, kuyu başına 10 flaş ayarı ve 0,2 saniyelik bir yerleşme süresi ile 600 nanometre dalga boyunda optik yoğunluğu ölçün. Floresansı ölçmeden önce, negatif kontrol kuyusu A24'e göre otomatik bir kazanç ve odak ayarı yapın ve kazanç hedef değerini %75 olarak ayarlayın.

Odak ayarını ve pencerenin sağındaki A kanalını seçin. GFP raportöründen gelen floresansı, kuyu başına 10 flaş ayarı ve 0,2 saniyelik bir yerleşme süresi ile maksimum 485 nanometre uyarma ve maksimum 520 nanometre emisyonda ölçün.

İncelenen tüm plakalardan veri toplayın. Veri okumaları, plaka okuyucu kontrol yazılımı tarafından varsayılan olarak otomatik olarak kaydedilir.

Verileri analiz etmek için, istatistiksel analiz paketini açmak üzere kontrol yazılımındaki Mars simgesine tıklayarak okumaları görüntüleyin. Analiz için verilere erişmek için ilgilenilen plaka numarasına çift tıklayarak verileri alın.

Sağlam bir Z asal analizi kullanarak testin tekdüzeliğini ve tekrarlanabilirliğini değerlendirin.

Ardından, büyümenin yüzde inhibisyonunu hesaplayın ve metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hücre içi c-di-GMP seviyesinin yüzde inhibisyonunu değerlendirin.