JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 3:37 dk. • October 30th, 2025
Membrana bağlı peptidaz NisP'yi eksprese eden bir Lactococcus lactis kültürü alın.
Kültürü besin açısından zengin bir ortamla karıştırın.
Erimiş agar ekleyin, karıştırın ve L. lactis'i agarda eşit olarak dağıtmak için bir tabağa dökün.
Katılaştıktan sonra, agarın içine kuyucuklar açın.
Daha sonra, antimikrobiyal peptit nisin'in vahşi tip veya modifiye edilmiş öncü varyantlarını üreten rekombinant E. coli'yi alın.
Bakterileri peletlemek için santrifüjleyin, süpernatanları atın ve peletleri tamponda yeniden süspanse edin.
Bakterileri parçalamak, santrifüjlemek ve süpernatanları taze tüplere aktarmak için sonikat yapın.
Tutarlı peptit seviyeleri sağlamak için lizatları tampon kullanarak eşit optik yoğunluğa normalleştirin.
Her numuneyi ayrı agar kuyucuklarına pipetleyin ve numuneleri inkübe edin.
İnkübasyon sırasında, Nisin öncü peptitleri agara yayılır ve NisP tarafından parçalanarak olgun nisin üretir.
Olgun nisin, L. lactis'in büyümesini engelleyerek kuyu çevresinde berrak haleler oluşturur.
Nisin varyantlarının antimikrobiyal aktivitesini değerlendirmek için halo boyutlarını karşılaştırın.
Mililitre başına 10 mikrogram kloramfenikol ve yüzde iki glikoz içeren 25 mililitre 2X M17 et suyuna bir mililitre Lactococcus lactis ön kültürü ekleyin. Daha sonra 25 mililitre ılık erimiş agar ekleyin, karıştırın ve çözeltiyi büyük bir petri kabına dökün. Steril koşulları koruyarak plakayı 10 ila 15 dakika kurutun.
Daha sonra cam Pasteur pipetinin uçlarını alevle sterilize edin. Pipet soğuduktan sonra, katılaşmış agarda delikler oluşturmak için geniş ucunu kullanın. Her numune için petri kabının altını karşılık gelen delik konumunun yanında etiketleyin.
Aktivite tahlili için, E.coli üretim kültürlerinin bir mililitrelik numunelerini alın ve bunları 7.000 kez g'da üç dakika santrifüjleyin. Kalan ortamı aspire edin ve hücre peletini pipetleme yoluyla 500 mikrolitre sodyum fosfat tamponunda yeniden süspanse edin.
Daha sonra, sonikatör probunun ucunu hücre süspansiyonuna batırarak numuneyi buz üzerinde sonikleştirin. Sonikasyonu başlatın. Daha sonra, hücre lizatını 13.000 kez g'da 10 dakika boyunca pelet hücre kalıntılarına santrifüjleyin.
Süpernatanı buz üzerinde yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın. Süpernatantları, hasat edilen hücre yoğunluğuna göre 0.6'ya eşit bir OD600'ün bir mililitresine seyreltin ve normalleştirin, sodyum fosfat tamponu ile karıştırın ve karıştırın. Antimikrobiyal aktiviteyi test etmek için, indikatör agarın belirlenen deliğine 40 mikrolitre normalleştirilmiş numune ekleyin.
Tüm numune agara yayılana kadar bekleyin. Plakayı gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, düz yataklı bir tarayıcı veya dijital kamera kullanarak agar plakasının fotoğraflarını çekin.
Büyüme inhibisyonu halo boyutu elle veya yazılım kullanılarak ölçülebilir.