Drosophila Sineklerinde Bağırsakla İlişkili Bakterilerin Koloni Oluşturan Birimlerinin Miktarının Belirlenmesi

Drosophila sineklerinden hazırlanan homojenatları içeren bir mikroplaka ile başlayın. Bu sinekler, bağırsaklarında belirli bir bakterinin kontrollü bir popülasyonunu barındırıyordu.

Homojenatlar, parçalanmış sinek dokuları ve salınan bağırsak bakterileri içerir.

Asılı bakterileri aspire edin ve birden fazla mikroplaka boyunca seri olarak seyreltin.

Her seyreltmeden küçük hacimleri agar plakalarına yerleştirin ve damlacıkların ayrı kalmasını sağlayın.

Bakterilerin görünür koloniler halinde çoğalmasına izin vermek için inkübe edin.

Bireysel koloniler oluşturabilen canlı bakteri hücrelerinin sayısını temsil eden koloni oluşturan birimleri (CFU'lar) ölçmek için plakaların görüntülerini yakalayın.

Görüntü analiz yazılımını kullanarak, her görüntüyü bir referans çizgisi kullanarak hizalayın, bir sınır tanımlayın ve her biri tek bir noktaya karşılık gelen sayma bölgelerine ayırmak için tek tip bir ızgara uygulayın.

Tek tek kolonileri arka plandan ayırt etmek için parlaklık eşiğini ayarlayın, ardından her noktadaki kolonileri saymak ve CFU'ları ölçmek için analizi çalıştırın.

Üç dikdörtgen MRS agar büyüme plakasını kapakları açık olarak en az 10 dakika kuruması için biyogüvenlik kabinine yerleştirin. 96 kanallı bir pipetleyici kullanarak steril 96 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre PBS ekleyerek iki seyreltme plakası hazırlayın. 96 kanallı pipetleyiciye bir raf P-20 ucu yükleyin.

Numune plakasından 11,1 mikrolitre homojenat aspire ederek 1:10 seyreltme yapın. Şimdi, kuyucuk başına 100 mikrolitre steril PBS içeren ilk seyreltme plakasına dağıtın. Seyreltme plakasını plaka çalkalayıcıda 10 saniye boyunca 600 RPM'de tutun.

En az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek tekrar karıştırın. 11.1 mikrolitreyi birinci seyreltme plakasından ikinci seyreltme plakasına aktarın ve daha fazla seyreltme için karıştırma adımlarını tekrarlayın. Plakaları tespit etmek için her kuyucuktan 96 kanallı pipetleyiciye iki mikrolitre yükleyin.

Pipetleyici başlığını yavaşça plakanın üzerine indirin, agarın içine saplanmasını önleyin ve tüm noktaların dağıtıldığından emin olun. Ardından, sıvı lekelerin hızla agara nüfuz ettiğini ve birlikte akmadığını kontrol edin. Kalan seyreltme plakaları için kaplama işlemini makalede açıklandığı gibi tekrarlayın.

Sıvı agar içine tamamen emildikten sonra, plakaları ters çevirin ve koloniler optimal boyuta ulaşana kadar inkübe edin. Fotoğraf çekerken plakaları mantıklı bir şekilde düzenleyin ve belirli bir sırada tutun. Tüm plakalar için A1 sol üst köşede olacak şekilde yönlendirin.

Plaka kapağını çıkardıktan sonra, plakayı A1 doğru köşeye gelecek şekilde sahneye yerleştirin. Plakaları hayal edin. Görüntüleri bir bilgisayara aktarın ve deney adı, ortam türü, seyreltme faktörü ve diğer ilgili ayrıntılar dahil olmak üzere yeniden adlandırın.

Niceleme için işlenecek görüntüleri bir klasörde düzenleyin. Kalıpları ayırt eden dosya adları, çıktı elektronik tablosundaki her sayım kümesi için sütun başlıkları haline gelir. Klasörde Kırpılmış ve Makbuzlar adlı alt klasörler oluşturun.

Bu klasörler çıktı dosyalarını alacaktır. Şimdi ImageJ'den Croptacular eklentisini başlatın ve kırpmaya başlamak için Tamam'a tıklayın. Kaynak klasörü seçmek için bir diyalog kutusu açılacaktır.

Tamam'ı tıklatın. Kaynak klasörü seçin ve Aç'ı tıklatın. Ardından, hedef dizini seçmek için diyalog kutusunda Tamam'ı tıklayın. Hedef klasörü seçin ve Aç'a basın.

Görüntü zaten düzse, Boşluk tuşuna basmanız yeterlidir. Aksi takdirde, yatay olması gereken bir kenar boyunca bir çizgi çizerek görüntüyü düzeltin. Görüntü düz görünmüyorsa çizgiyi gerektiği kadar yeniden çizin.

Ardından, sayma alanı için bir sınır kutusu çizin ve tüm noktalar hücrelerinin içine girene kadar boyutunu ve oranını ayarlayın. Izgarayı yenilemek için imleci sınır kutusunun dışına sürükleyin. Izgara iyi göründüğünde Boşluk tuşuna basın.

Eklenti tüm fotoğrafların aynı şekilde hizalanacağını varsaydığından, bir sonraki görüntünün otomatik olarak ilkiyle aynı açıya döndüğünden emin olun. Bu doğruysa, devam etmek için Boşluk tuşuna basın. Aksi takdirde, görüntüyü daha önce olduğu gibi düzeltin.

Izgara ayrıca önceki görüntüyle aynı konumu hatırlar. Gerekirse ayarlayın ve Boşluk tuşuna basın. Count-On-It'i başlatın ve Gridiron'u seçin.

Eşik koloni yoğunluğunu bir üst ve bir alt piksel yoğunluğu değerine göre ayarlayın. Tüm kolonileri seçmeye devam ederken eşiği mümkün olduğunca katı hale getirin. Eşik tatmin edici olduğunda Eylem Gerekli iletişim kutusunda Tamam'ı tıklayın, ardından devam etmek için Tamam'ı tıklayın.

İlk resimde, devam etme veya kurulum menüsüne dönme seçeneği verilmiştir. Toplu işleme devam etmek için Tamam'ı tıklatın. Ardından, makbuzları ve sonuçları tabloyu tutmak için bir klasör seçin. Daha önce oluşturulan Makbuzlar klasörünü kullanın.

İlk görüntüden sonra, sonraki görüntüler varsayılan olarak önceki ayarlarla aynı eşiğe ayarlanacaktır. Bu ayarları kullanmak veya ayarları yapmak için Tamam'ı tıklatın.