Neisseria gonorrhoeae'deki Yüzey Metal Taşıyıcılarının Nokta Blot Kullanılarak Tespiti

Metal tükenmiş bir ortamda yetiştirilen bir Neisseria gonorrhoeae kültürü ile başlayın.

Metal kıtlığı, mevcut olduğunda metal alımını başlatan dış membran taşıyıcılarının ekspresyonunu tetikler.

Nemli filtre kağıtlarının üzerine önceden ıslatılmış nitroselüloz membranı yerleştirin ve nokta lekeleme aparatını monte edin.

Bakteri hücrelerini tespit edin ve sıvının emilmesine izin verin.

Cihazı sökün, membranı çıkarın ve havayla kurutun.

Belirli olmayan bağlamayı önlemek için bir engelleme aracısı ekleyin.

Membranı aparata tekrar yerleştirin, parafilm ile kapatın ve yeniden monte edin.

Konakçıdan türetilmiş bir metal bağlayıcı ligand ekleyin ve çalkalayarak inkübe edin.

Ligand, bakteri taşıyıcılarına bağlanır.

Sıvıyı çıkarın ve bağlanmamış ligandı çıkarmak için zarı yıkayın.

Liganda özgü bir birincil antikor, ardından enzim konjuge bir ikincil antikor ve renkli bir ürün oluşturan bir kolorimetrik saptama reaktifi ekleyin.

Görünür bir sinyal, metal sınırlı koşullar altında bakteriyel metal taşıyıcılarının ekspresyonunu gösterir.

Kütle ikiye katlama inkübasyonundan sonra, kültürleri üç cilt CDM ile seyreltin. Daha sonra kültürleri 37 santigrat derecede çalkalayarak dört saat inkübe edin. Dört saat