Neisseria gonorrhoeae'deki Yüzey Metal Taşıyıcılarının Nokta Blot Kullanılarak Tespiti

Metal tükenmiş bir ortamda yetiştirilen bir Neisseria gonorrhoeae kültürü ile başlayın.

Metal kıtlığı, mevcut olduğunda metal alımını başlatan dış membran taşıyıcılarının ekspresyonunu tetikler.

Nemli filtre kağıtlarının üzerine önceden ıslatılmış nitroselüloz membranı yerleştirin ve nokta lekeleme aparatını monte edin.

Bakteri hücrelerini tespit edin ve sıvının emilmesine izin verin.

Cihazı sökün, membranı çıkarın ve havayla kurutun.

Belirli olmayan bağlamayı önlemek için bir engelleme aracısı ekleyin.

Membranı aparata tekrar yerleştirin, parafilm ile kapatın ve yeniden monte edin.

Konakçıdan türetilmiş bir metal bağlayıcı ligand ekleyin ve çalkalayarak inkübe edin.

Ligand, bakteri taşıyıcılarına bağlanır.

Sıvıyı çıkarın ve bağlanmamış ligandı çıkarmak için zarı yıkayın.

Liganda özgü bir birincil antikor, ardından enzim konjuge bir ikincil antikor ve renkli bir ürün oluşturan bir kolorimetrik saptama reaktifi ekleyin.

Görünür bir sinyal, metal sınırlı koşullar altında bakteriyel metal taşıyıcılarının ekspresyonunu gösterir.

Kütle ikiye katlama inkübasyonundan sonra, kültürleri üç cilt CDM ile seyreltin. Daha sonra kültürleri 37 santigrat derecede çalkalayarak dört saat inkübe edin. Dört saat işaretinden kısa bir süre önce, üç parça filtre kağıdı ve bir parça nitroselülozu, bir nokta leke aparatına sığması için gereken yaklaşık boyuta kesin.

Aparatı nitroselülozun altına filtre kağıdı ile monte etmeden önce nitroselülozu yaklaşık 10 dakika deiyonize suda önceden ıslatın. İnkübasyonun sonunda, hücre yoğunluklarını kaydedin ve yoğunlukları uygun bir nihai yoğunluğa standartlaştırın. Daha sonra hücre kültürlerini nitroselüloz üzerine pipetleyin.

Filtre kağıdı tüm sıvıyı emdiğinde, aparatı sökün ve lekenin kurumasını bekleyin. Nitroselüloz membranı uygun bir bloke edici solüsyonla bir saat bloke edin ve nitroselülozun altında sızdırmaz bir conta oluşturmak için filtre kağıdını parafin filmle değiştirerek nokta-leke aparatını yeniden monte edin. İlgilenilen metal bağlayıcı ligandı blokerde 0.2 mikromolar ile seyreltin ve hücreleri orta derecede çalkalama ile bir saat boyunca inceleyin.

İnkübasyonun sonunda, sıvıyı vakumla sifonlayın, lekeyi yıkayın ve sinyali geliştirmek için standart immünolojik prosedürleri izleyin.