Mycobacterium smegmatis Yanlış Çeviri Oranlarının GFP/Lusiferaz Raportör Sistemi Kullanılarak Ölçülmesi

GFP için indüklenebilir genleri ve salgı sinyali etiketli mutant lusiferazı barındıran bir Mycobacterium smegmatis kültürünü ele alalım.

Mutant gen, aktif olmayan bir lusiferazı kodlar, ancak protein sentezi sırasında doğal yanlış çeviri, aktif bir enzim üretir.

GFP, lusiferaz ekspresyonunu normalleştirmek için dahili bir kontrol görevi görür.

Gen ekspresyonunu başlatmak için indükleyiciyi ekleyin, ardından kültürü çok oyuklu bir plakaya ayırın.

Seçilen kuyucuklara bir test molekülünün artan konsantrasyonlarını tanıtın. Kuluçkaya yatırın.

Kontrol koşulları altında, yanlış çeviri aktif lusiferaz sekresyonu ile sonuçlanır.

Test molekülü yanlış translasyonu engellerse, aktif lusiferaz sekresyonu azalır.

Kültür alikotlarını siyah bir plakaya aktarın ve GFP floresansını ölçün.

Hücreleri peletlemek için santrifüj.

Salgılanan lusiferaz içeren süpernatanları aktarın ve aktif lusiferazın oksidasyonunu katalize ederek lüminesans ürettiği substratı ekleyin.

Lüminesansı ölçün ve Luciferase/GFP oranını hesaplayın; daha düşük bir oran, test molekülü nedeniyle yanlış çevirinin azaldığını gösterir.

Başlamak için, iki mililitre 7H9 ortamını bakteri raportör suşu ile aşılayın.

Bir ila iki gün boyunca veya 600 nanometredeki OD sabit faza ulaşana kadar 37 santigrat derecede çalkalayın.

Daha sonra, 50 mililitre 7H9 ortamında alt kültür ve 600 nanometredeki OD geç durağan faza ulaşana kadar büyür. Bakterileri 96 oyuklu bir plakaya ayırmadan önce, mililitrede 50 nanogramlık bir nihai konsantrasyonda ATC ekleyin ve iyice karıştırın.

Berrak, yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya kuyucuk başına 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, yanlış çeviri oranları üzerindeki etkilerini taramak için seçilen kuyucuklara farklı dozlarda Ksg ekleyin. Numune kuyucuklarından buharlaşmayı sınırlamak için plakanın kenar kuyucuklarına 200 mikrolitre steril su ekleyin.

Plakayı kapatın, çalkalayın ve numuneleri 16 ila 20 saat boyunca 37 santigrat derecede indükleyin. Her kuyucuktan 80 mikrolitre almak için çok kanallı bir pipet kullanın. Numuneleri siyah tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve GFP sinyalini luminometre ile ölçün.

GFP sinyalini ölçtükten sonra, plakayı 10 dakika boyunca 3.220 kez g'de santrifüjleyin. Ardından, 50 mikrolitre süpernatantı beyaz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın.

Ardından, her bir oyuğa 50 mikrolitre Nluc substratı ekleyin, iyice karıştırın ve lüminesansı luminometre ile ölçün. Son olarak, düzeltilmiş Nluc lüminesans değerini GFP floresansına bölerek Nluc/GFP oranını belirleyin.