Mycobacterium smegmatis Yanlış Çeviri Oranlarının GFP/Lusiferaz Raportör Sistemi Kullanılarak Ölçülmesi

GFP için indüklenebilir genleri ve salgı sinyali etiketli mutant lusiferazı barındıran bir Mycobacterium smegmatis kültürünü ele alalım.

Mutant gen, aktif olmayan bir lusiferazı kodlar, ancak protein sentezi sırasında doğal yanlış çeviri, aktif bir enzim üretir.

GFP, lusiferaz ekspresyonunu normalleştirmek için dahili bir kontrol görevi görür.

Gen ekspresyonunu başlatmak için indükleyiciyi ekleyin, ardından kültürü çok oyuklu bir plakaya ayırın.

Seçilen kuyucuklara bir test molekülünün artan konsantrasyonlarını tanıtın. Kuluçkaya yatırın.

Kontrol koşulları altında, yanlış çeviri aktif lusiferaz sekresyonu ile sonuçlanır.

Test molekülü yanlış translasyonu engellerse, aktif lusiferaz sekresyonu azalır.

Kültür alikotlarını siyah bir plakaya aktarın ve GFP floresansını ölçün.

Hücreleri peletlemek için santrifüj.

Salgılanan lusiferaz içeren süpernatanları aktarın ve aktif lusiferazın oksidasyonunu katalize ederek lüminesans ürettiği substratı ekleyin.

Lüminesansı ölçün ve Luciferase/GFP oranını hesaplayın; daha düşük bir oran, test molekülü nedeniyle yanlış çevirinin azaldığını gösterir.

Başlamak için, iki mililitre 7H9 ortamını bakteri raportör suşu ile aşılayın.

Bir ila iki gün boyunca veya 600 n