Siyanobakteriyel Kültür Senkronizasyonu ve Aydınlık-Karanlık Döngüleri Tarafından Yönlendirilen DNA Sıkıştırma

Tiyosülfat ile desteklenmiş, besin açısından zengin bir agar plakası ile başlayın.

Sirkadiyen döngüyü sürdürmek için siyanobakterileri çizin ve değişen aydınlık ve karanlık dönemler altında inkübe edin.

Işık döneminde besin alımı ve tiyosülfat bakteri üremesini ve DNA'nın yoğunlaşmasını destekler.

Karanlık dönemde hücreler enerji tasarrufu yapar ve bölünür.

Alternatif aydınlık-karanlık döngüsü, hücreleri aynı büyüme ve bölünme aşamasına senkronize eder.

Işık süresinden sonra, renk değişikliğine neden olan siyanobakterileri serbest bırakmak için bir sakaroz çözeltisi ve pipet ekleyin. Hücreleri bir tüpe aktarın.

DNA'ya özgü bir floresan boya ekleyin ve karanlıkta inkübe edin. Boya, siyanobakteriyel DNA'ya bağlanır.

Siyanobakterileri ayırmak ve süpernatanı çıkarmak için santrifüjleyin.

Siyanobakterileri sakaroz çözeltisinde yeniden süspanse edin, süspansiyonu bir slayta aktarın ve üzerini örtün.

Bir floresan mikroskobu altında, hücrelerdeki mavi yoğunlaştırılmış DNA, siyanobakteriyel hücre döngüsünün senkronize, sirkadiyen tarafından düzenlenen ilerlemesini doğrular.

%1,5 agar ve %0,3 sodyum tiyosülfat içeren dokuz santimetrelik, sterilize edilmiş BG-11 plakaları üzerinde siyanobakteri yetiştirmeye başlayın. Plakaları saniyede metrekare başına 50 mikro-E ışıkla 12-12 ışık döngüsü altında 23 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri korumak için haftalık olarak taze BG-11 agar plakalarına aktarın.

Bir hafta içinde kültürler yeşil bantlar olarak görünür. Yeşil hücre kümelerini alevle sterilize edilmiş bir halka kullanarak aktarın ve bunları yeni plakaya çizin. DNA sıkışmasını gözlemlemek için, ışık periyodunun sonunda altı gün boyunca kültürlenen hücreleri toplayın.

Hücreleri plakadan çıkarmak için bir mililitre 0.2 molar sakaroz ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu toplayın ve çözelti yeşile dönene kadar sakaroz ekleme ve çıkarma işlemini tekrarlayın. Renk değişimi, çoğu hücrenin serbest bırakıldığını gösterir.

Şimdi, 500 mikrolitre askıda hücre çözeltisini bir Mikrofüj tüpüne aktarın ve mililitrede bir mikrogramlık nihai konsantrasyon için Hoechst boyası ekleyin. Daha sonra hücrelerin karanlıkta 10 dakika inkübe etmesine izin verin. Daha sonra hücreleri döndürün, süpernatanı atın ve 10 mikrolitre 0,2 molar sükroz içinde yeniden süspanse edin.

Daha sonra, süspansiyonun bir mikrolitresini bir cam slayta aktarın, bir lamel takın ve hücreleri bir UV filtresi ile donatılmış bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin. 100 kat yağa daldırma hedefi kullanarak, hücrelerin çoğunda gözlemlenebilir olması gereken DNA sıkışmasının kanıtını arayın.