Hücresiz Bir Sistem Kullanılarak Nanodisk ile Stabilize Edilmiş Membran Protein Antijenlerinin Sentezi

Bozulmamış hücresel yapılardan yoksun, ancak in vitro transkripsiyon ve translasyon için gerekli moleküler bileşenleri koruyan bakteri hücresiz bir sistemi ele alalım.

Sentetik fosfolipidler ve polimerlerle birlikte membran protein antijenini ve iskele proteinini kodlayan plazmitleri tanıtın.

Protein sentezini başlatmak için karışımı ATP, GTP ve bir amino asit karışımı ile destekleyin.

Eş zamanlı olarak amino asit karışımıyla zenginleştirilmiş bir yem çözeltisi hazırlayın.

Karışımı iç hazneye ve besleme solüsyonunu çift bölmeli diyaliz cihazının dış haznesine yükleyin.

İnkübasyon sırasında, substratlar yarı geçirgen zar yoluyla dış odadan iç odaya yayılarak plazmit transkripsiyonunu ve protein translasyonunu kolaylaştırır.

İskele proteini, fosfolipidleri ve polimerleri lipid nanodiskler halinde birleştirir ve MPA'nın bu yapılara katlanmasını ve dahil edilmesini kolaylaştırır.

Reaksiyon sırasında üretilen yan ürünler dış odaya yayılarak nanodiskle stabilize edilmiş MPA oluşumu için en uygun koşulları korur.

MOMP-tNLP'leri hücresiz bir yöntem kullanarak hazırlayın.

Reaksiyonu ayarlamadan iki saat önce hücresiz protein ekspresyon kitinden sulandırma tamponunu çözün ve tampona EDTA içermeyen proteaz inhibitörü ekleyin. Beş adet bir mililitrelik reaksiyonu çalıştırmak için tasarlanmış bir kit kullanın. Her bir mililitrelik reaksiyon için, E.coli lizat şişesine 525 mikrolitre sulandırma tamponu ekleyin ve çözünmesi için yuvarlayın.

Katkı maddesini içeren reaksiyon şişesine 250 mikrolitre sulandırma tamponu ekleyin ve yuvarlayarak çözün. Ardından, reaksiyon besleme şişesine 8,1 mililitre sulandırma tamponu ekleyin ve çözünmesi için yuvarlayın. Bir şişe amino asit karışımına, çözmek için üç mililitre sulandırma tamponu ekleyin.

Başka bir metiyonin şişesine 1,8 mililitre sulandırma tamponu ekleyin, çözün ve buz üzerinde saklayın. E.coli lizat şişesine 225 mikrolitre sulandırılmış karışım, 270 mikrolitre metiyonin içermeyen sulandırılmış amino asit karışımı ve 30 mikrolitre sulandırılmış metiyonin ekleyin. Ayrıca, karışıma 400 mikrolitre DMPC/telodendrimer karışımı, 15 mikrogram MOMP plazmidi ve 0.6 mikrogram delta-49 ApoA1 ekleyin ve karıştırın.

1.5 mililitrelik bir tüpte toplam çözeltinin 20 mikrolitresini ayırın GFP eksprese eden bir kontrol reaksiyonu için. Metiyonin içermeyen sulandırılmış amino asit karışımından 2.65 mililitre ve 300 mikrolitre sulandırılmış metiyonin ekleyerek bir yem çözeltisi hazırlayın. Reaksiyon çözeltisinin bir mililitresini hücresiz reaksiyon kitindeki iç reaksiyon odasına aktarın ve kapatın.

Reaksiyon kabının dış haznesini 10 mililitre besleme solüsyonu ile doldurun ve kapatın. Reaksiyon karışımının 20 mikrolitrelik alikotlarına 0,5 mikrolitre GFP kontrol plazmidi ekleyin. Reaksiyonu 30 santigrat derecede 18 saat boyunca dakikada 300 devirde bir çalkalayıcıya koyun.

GFP sentezine bağlı floresan için 15 dakika sonra reaksiyonu UV ışığı altında izleyin.