Yüksek Voltajlı Elektroporasyon Kullanılarak Bakterilerin Hazırlanması ve Dönüşümü

Bir besin ortamına aşılanmış bakteri içeren bir tüple başlayın.

Hücreler aktif olarak bölünme fazına ulaşana kadar çalkalayarak inkübe edin.

Hücreleri toplamak ve süpernatanı atmak için santrifüjleyin.

Tuzları çıkarmak için hücreleri buz gibi soğuk gliserol ile tekrar tekrar yıkayın ve hücre canlılığını korumak için gliserol içinde yeniden süspanse edin.

DNA bozulmasını önlemek için EDTA'lı steril suda antibiyotik direnç geni içeren bir plazmit hazırlayın.

Plazmit çözeltisini bakteri hücreleriyle karıştırın.

Bakteri zarında geçici olarak gözenekler oluşturmak için kısa, yüksek voltajlı bir darbe uygulayın.

Bu, plazmit DNA'nın sitoplazmaya girmesine izin verir.

Hücreleri hemen bir geri kazanım ortamına aktarın ve çalkalayarak inkübe edin.

Ortamın bileşenleri, membran onarımını ve plazmit kodlu antibiyotik direnç gen ekspresyonunu destekler.

Hücreleri antibiyotik içeren besleyici agar üzerine yayın ve koloniler oluşana kadar inkübe edin.

Tek bir koloni seçin ve dönüştürücüleri saflaştırmak için yeni bir tabağa koyun.

Deneye başlamak için, ilk 10 E. coli suşunun elektrokompetan hücrelerini hazırlayın.

Tek bir koloniyi bir mililitre LB ortamına aktarın. Tüpü 180 RPM'de çalkalarken 37 santigrat dere