JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 3:54 dk • October 30th, 2025
Fotosentetik bakteriler olan siyanobakteri kültürüyle başlayın.
Bu bakteriler, fotosentetik pigmentler açısından zengin katlanmış membranöz yapılar olan lipid açısından zengin plastoglobül damlacıkları ve tilakoid membranlar içerir.
Kültürü santrifüjleyin ve bakteri tarafından üretilen hücre dışı polisakkaritleri uzaklaştırmak için süpernatanı atın. Peleti yıkayın, ardından bir tamponda yeniden süspanse edin.
Hücre duvarlarını ve zarlarını bozan kesme kuvveti oluşturmak için yüksek basınçlı bir homojenleştirici kullanın.
Tilakoid zarların yırtılması, lizata fotosentetik pigmentler salgılar. Pigment salınımı, hücre bozulmasını ve plastoglobül salınımını gösteren bir renk değişikliğine neden olur.
Lizatı santrifüj tüplerine yükleyin, ardından bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için bir sakaroz çözeltisi ekleyin.
Hücresel bileşenleri yoğunluğa göre ayırmak için santrifüj.
Tilakoid ve diğer ağır bileşenler altta topaklanırken, düşük yoğunluklu plastoglobüller ayrı bir bant olarak üste doğru yüzer.
Plastoglobül fraksiyonunu toplayın ve daha fazla analiz için dondurarak saklayın.
Durağan faza ulaşmak için BG11 ortamında 7 ila 10 gün boyunca 50 mililitre synechocystis türü PCC 6802 kültürü büyütün.
Bir spektrofotometre kullanarak hücre yoğunluğunu 2.0 nanometrede 750 optik yoğunluğa ayarlayın. Polisakkaritleri çıkarmak için 50 mililitre kültürü santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Hücrelerin 50 mililitre tampon A içinde yıkanmasını iki kez tekrarlayın.
Yıkanmış peleti 25 mililitre tampon A'da yeniden süspanse edin ve 1.100 pound inç karede bir Fransız basınç hücresi kullanarak hücreleri kırın. Beyaz ışık altında parçalanmış renk yeşilden kırmızı-mavi-yeşile dönene kadar işlemi soğuk koşullarda üç kez tekrarlayın. Hücre homojenatının alikotunu çıkarın ve temsili bir toplam hücre örneği olarak saklanmak üzere bir kenara koyun.
Elde edilen homojenatı, her tüpte maksimum 2,5 mililitreye kadar doldurulmuş sekiz adet üç mililitrelik ultrasantrifüj tüpüne dağıtın. Bu homojenatı 400 mikrolitre orta R ile kaplayarak bir adım gradyanı oluşturun. Tüpleri santrifüjlemeden önce gerektiği kadar ilave ortam R ekleyerek tüpleri dikkatlice dengeleyin.
Herhangi bir polihidroksialkanoat cisimciği de dahil olmak üzere tilakoid ve diğer ağır organeller pelet oluşumu gösterirken, plastoglobüller sakaroz gradyanının tepesinde veya yakınında sarı yağlı bir ped oluşturur. Elde edilen yüzen ham plastoglobül pedini bir şırınga ile hasat edin ve hasadı iki mililitrelik bir tüpe bırakın.
Gerekirse ultrasantrifüj tüpü duvarının yan tarafındaki plastoglobülleri bir iğne ucuyla kazıyın. Ya siyanobakteri işlemeye devam edin ya da ham plastoglobülleri eksi 80 santigrat derecede saklayın ve daha sonra saflaştırın.