Mikropsuz C. elegans'de Bağırsak Bakteri Kolonizasyonunun Değerlendirilmesi

Mikropsuz yetişkin C. elegans solucanları ile başlayın.

Test bakterisini tanıtın ve inkübe edin.

Solucanlar beslenirken bakteriler bağırsak lümenine girer ve epitele yapışır.

Solucanları peletlemek ve yutulmayan bakterileri uzaklaştırmak için santrifüj.

Tamponda yeniden süspanse edin, santrifüjleyin ve kalan yutulmamış bakterileri çıkarın.

Isı ile öldürülmüş E. coli içeren ortamı ekleyin ve inkübe edin.

Beslenme sırasında, ısıyla öldürülen E. coli , yapışmamış test bakterilerini bağırsak lümeninden uzaklaştırır ve dışarı atar.

Dışarı atılan bakterileri içeren süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın.

Tamponla yıkayın, santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.

Felce neden olmak ve daha fazla yutulmasını önlemek için solucanları buz üzerinde soğutun.

Bir ağartıcı çözeltisi ekleyin ve kalan dış bakterileri öldürmek için inkübe edin.

Çamaşır suyunu çıkarın ve soğuk tampon ekleyin.

Artık ağartıcıyı ortadan kaldırmak için süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın.

Solucanlar artık yalnızca bağırsak epiteline yapışmış canlı test bakterilerini tutuyor ve bu da kolonizasyonun nicelleştirilmesini sağlıyor.

Solucan örneğini bir mikrosantrifüj tüpünde bir mililitre M9TX-01 içinde yeniden süspanse ederek başlayın. Yetişkin solucanları santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın. Aynı santrifüjleme parametrelerini kullanarak, dış bakterileri en aza indirmek için solucanları iki kez bir mililitre M9TX-01 ve bir kez bir mililitre M9 solucan tamponu ile durulayın. Ardından, her numuneyi bir mililitre S ortamı artı 2X ısıyla öldürülmüş OP50'de bir kültür tüpünde yeniden süspanse edin. Yapışmamış bakterileri bağırsaktan geçirmek için tüpleri 25 santigrat derecede 20 ila 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, temizlenmiş solucanları bir mililitre soğuk M9TX-01 ile iki kez durulayın ve süpernatanı atın. Solucanları felç etmek için tüpleri 10 dakika buza koyun. Ardından, her tüpe kokusuz ağartıcı içeren bir mililitre buz gibi soğuk M9 solucan tamponu ekleyin.

Dış bakterileri öldürmek için tüpleri buz üzerinde en az 10 dakika inkübe edin. Çamaşır suyu tamponunu atın ve solucanların pompalanmasını önlemek için tüpleri buza geri koyun. Ardından, her tüpe bir mililitre soğuk M9TX-01 ekleyin ve mini bir santrifüjde beş saniye santrifüjleyin. Tüpleri buza geri koyun ve süpernatanı çıkarın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.