Vibrio natriegens'ten Ham Hücre Ekstraktının Hazırlanması

Hücresel bozulmayı önlemek için soğutulmuş bir tamponda yüksek protein sentez hızına sahip bir Vibrio natriegens süspansiyonu alın.

Soğuk koşullar altında santrifüjleyin.

Kirleticileri gidermek için süpernatanı atın.

Peleti küçük bir hacimde soğutulmuş tamponda yeniden süspanse edin.

Geniş çaplı bir uç kullanarak, mekanik kesmeyi önlemek için süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Süspansiyonu karıştırın ve tüpü buz üzerine yerleştirilmiş bir tutucuya yerleştirin.

Sonikatör ucunu süspansiyona indirin.

Hücre zarını bozmak ve sitoplazmik içerikleri serbest bırakmak için sonikasyonu başlatın.

Çözünmeyen hücre kalıntılarını ayırmak için santrifüj.

Sitoplazmik içerik içeren süpernatan veya ham hücre ekstraktını taze bir tüpe toplayın.

Biyoaktivitesini korumak için hücre ekstraktını sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.

Hücresiz protein ekspresyonunda daha fazla kullanım için ultra düşük sıcaklıklarda saklayın.

Taze hazırlanmış S30 lizis tamponu pH 7.7'yi yaklaşık dört santigrat dereceye soğutun, Aynı bir litrelik kültürden elde edilen tüm peletleri yeniden süspanse etmek ve süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarmak için bu soğuk S30 lizis tamponunun 10 mililitresini kullanın. Bu süspan