Rekombinant Bakteriyel Proteinin Arındırılması için Afinite Kromatografi Tekniği
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:54 dk. • November 28th, 2025
Polihistidin etiketli bir hedef proteini ifade eden bakteri hücrelerinin bir süspansiyonunu ele alalım.
Protein bozulmasını en aza indirmek için buz üzerinde sonikasyon yapın. Yüksek frekanslı ses dalgaları hücreleri liz eder ve hedef protein dahil olmak üzere hücre içi içerikleri serbest bırakır.
Santrifüjle kalıntıları ayırmak ve üst proteinleri içeren proteinleri bir şırıngaya aktarmak.
Agregaları çıkarmak ve kromatografi kolonunun tıkanmasını önlemek için süpernatantı filtreleyin.
Nikel bazlı bir affinite kromatografi kolonu alın ve optimal protein saflaştırması için dengeleyin.
Filtratı kolona yükleyin. Polihistidin etiketi, sütun reçinesi üzerindeki nikel iyonlarına bağlanarak hedef proteinleri immobilize eder.
Kolonu bir tampon ile yıkayarak bağlanmamış proteinleri çıkarın ve eluatın UV emiciliğini izleyerek hedef olmayan proteinlerin çıkarıldığını doğrulayın.
Nikel bağlanması için polihistidin etiketiyle rekabet eden imidazol içeren bir elusiyon tamponu ekleyin ve proteinler serbest bırakılır.
UV emilimindeki ikinci bir artış, hedef proteinin elülasyonunu doğrular ve bu protein sonraki kullanıma hazırdır.
Hücreleri buz üzerindeki beş döngü boyunca 15 saniyelik bir darbe ve 30 saniye
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin