Rekombinant Bakteriyel Proteinin Arındırılması için Afinite Kromatografi Tekniği

0 görüntüleme2:54 dk • November 28th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polihistidin etiketli bir hedef proteini ifade eden bakteri hücrelerinin bir süspansiyonunu ele alalım.

Protein bozulmasını en aza indirmek için buz üzerinde sonikasyon yapın. Yüksek frekanslı ses dalgaları hücreleri liz eder ve hedef protein dahil olmak üzere hücre içi içerikleri serbest bırakır.

Santrifüjle kalıntıları ayırmak ve üst proteinleri içeren proteinleri bir şırıngaya aktarmak.

Agregaları çıkarmak ve kromatografi kolonunun tıkanmasını önlemek için süpernatantı filtreleyin.

Nikel bazlı bir affinite kromatografi kolonu alın ve optimal protein saflaştırması için dengeleyin.

Filtratı kolona yükleyin. Polihistidin etiketi, sütun reçinesi üzerindeki nikel iyonlarına bağlanarak hedef proteinleri immobilize eder.

Kolonu bir tampon ile yıkayarak bağlanmamış proteinleri çıkarın ve eluatın UV emiciliğini izleyerek hedef olmayan proteinlerin çıkarıldığını doğrulayın.

Nikel bağlanması için polihistidin etiketiyle rekabet eden imidazol içeren bir elusiyon tamponu ekleyin ve proteinler serbest bırakılır.

UV emilimindeki ikinci bir artış, hedef proteinin elülasyonunu doğrular ve bu protein sonraki kullanıma hazırdır.

Hücreleri buz üzerindeki beş döngü boyunca 15 saniyelik bir darbe ve 30 saniyelik bir duraklama ile sonikle yapın.

Hücre lizatını 21.000 g ve dört derece Celsius'ta 15 dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, süpernatantı steril bir şırınga filtre sistemiyle filtreleyin. HIS etiketli RTA fraksiyonunu, steril filtrelenmiş E.coli süpernatantından arındırmak için beş mililitrelik nikel bazlı affinite kolonuyla donatılmış otomatik bir arıtma sistemi kullanın. Genel olarak, dakikada bir mililitre elüsyon hızı kullanın ve tüm arıtma sistemini soğutarak verimli olmayan toksin bağlanmasını ve toksin aktivitesinin kaybını önleyin.

Kısa bir süreliğine affinite sütununu 20 mililitre bağlama tamponu ile dengeleyerek depolama tamponunu kaldırın. Sonra, steril, filtrelenmiş süpernatantı bir şırınga ile affinite kolonuna uygulayın. Kolonu 25 ila 35 mililitre bağlama tamponu ile yıkayarak bağlanmamış proteinleri kolondan çıkarın.

Yıkama adımını, 280 nanometrede UV emilimi başlangıçtaki UV değerine yaklaşana kadar gerçekleştirin. Sonra, bağlı RTA fraksiyonunu 20 ila 35 mililitre elution tamponu ile elüasyon yapın ve örneği buz üzerinde tutun. UV 280 değeri arttıktan kısa süre sonra RTA fraksiyon örneklemesine başlamak ve RTA fraksiyon örneklemesini tekrar orijinal tabana ulaştığında durdurmak önemlidir.

09:54

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:35

Immobilize Metal Affinity Kromatografisinde Metal Yıkamanın Ölçülmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:19

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:32

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:44

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

İlgili videolar

0 Görüntüler

02:59

Anyon değişim kromatografisi bazlı protein saflaştırması: Net yüke dayalı olarak diyaliz edilmiş bakteri lizatından ilgilenilen bir proteini izole etmek için bir ayırma tekniği

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:54

Nikel Afinite Kromatografisi Bazlı Protein Saflaştırması: Polihistidin Etiketli Rekombinant Proteinleri Bakteriyel Hücre Lizatından Saflaştırmak İçin Bir Teknik

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:03

Monoklonal Antikorların Saflaştırılması için Bir Afinite Kromatografisi Tekniği

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:03

Afinite Kromatografisi Kullanılarak Kendi Kendine Birleşen Protein Nanopartiküllerinin Saflaştırılması

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:22

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 1 Ağustos 2026