Escherichia coli'de floresan etiketli repressör protein aracılı replikasyon blokajı

Genetik olarak tasarlanmış bir E. coli kültürünü, kromozom tetrasiklin operatörü (tetO) dizisini ifade edelim.

Bakteriler ayrıca YFP etiketli tetrasiklin repressör proteininin ekspresyonunu sağlayan arabinoz indüklenebilir bir promotorlu plazmid taşır.

Kültürü antibiyotik içeren zenginleştirilmiş bir besin ortamına aktarın ve plazmid taşıyan hücreleri seçmek için çalkalama ile kuluçka yapın.

Hücreler büyüdükçe, replisomlar oluşur ve kromozomal DNA çoğalmasını başlatır.

Üstel aşamada, indüklenmemiş kontrol olarak bir kısmı toplayın.

Kalan kültüre bir indüktör olan arabinoz ekleyin ve her iki kültürü de sallama ile kuluçkaya geçirin.

İndüklenmemiş kültürde, AraC dimeri DNA döngüsüne bağlı kalır ve repressör ifadesini engeller.

İndüklenen kültürde, arabinoz AraC dimerine bağlanır ve repressör ifadesini tetikler.

Repressör proteinler kromozom tetO dizisine bağlanarak çoğaltma çatal ilerlemesini durdurur.

Her iki kültürü de gözlemlemek için floresan mikroskopisi kullanın.

İndüklenen E. coli kültüründeki floresan odaklar, baskılayıcı protein aracılı replikasyon blokajını doğrular.

Bu işlem için pKM1 plazmidinde tetrasiklin operatör dizisi taşıyan bir E. coli suşu kullanılır. pKM1, indüklenebilir sa