JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:48 dk • November 28th, 2025
Zincir yer değiştiren DNA polimeraz, nukleotidler ve döngü aracılı izotermal amplifikasyon veya LAMP için çift zincirli DNA bağlayıcı boya içeren bir master karışım alın.
Hedef bakteriyel gene özgü ters tamamlayıcı dizili içeren primerler ekleyin.
Ana karışımı tüplere dağıtın.
Tüplere bakteriyel DNA şablonları içeren örnekler ekleyin.
Tüpleri bir LAMP enstrümanının içine yerleştirin.
İlk denatürasyon, primerin hedef DNA'ya bağlanmasını sağlar.
Zinciri yer değiştiren DNA polimeraz yeni bir iplik sentezlemeye başladığında, mevcut zinciri yerinden çıkarır ve termal döngüye gerek kalmaz.
Amplifikasyonlu çarpım, ters tamamlayıcı eşleşme nedeniyle döngülü bir yapı oluşturur.
Bu yapı, bir sonraki döngü için birden fazla başlangıç noktası içerir ve hedef DNA'nın üstel olarak amplifikasyonunu kolaylaştırır.
Boya amplifikasyonlu DNA'ya bağlanır ve floresans yayar.
Floresansı gerçek zamanlı olarak izleyerek örneklerdeki hedef bakteri geninin varlığını tespit edin.
LAMP Master Mix'in hazırlanması ve DNA şablonlarının eklenmesi için kullanılan alanları fiziksel olarak ayırın.
Çalışma yüzeylerini izopropanol ve DNA ile DNAZ bozucu çözelti ile temizleyin. Sonra pipetleri ve tüp şerit tutucularını temizleyin. İzotermal Master Mix, 10X Primer Mix, moleküler derece su, pozitif kontrol DNA'sı ve DNA şablonlarını oda sıcaklığında eritin.
LAMP enstrümanını açın ve ilgili örnek bilgilerini girin. LAMP Master Mix'i el yazması yönergelerine göre hazırlayın, kısa bir süre girdabla ve santrifüj yapın, ayrıca 23 mikrolitre Master Mix'i bir tüp şeridinin her kuyusuna dağıtın. Tüm DNA şablonlarını girdabla geçirip kısa süreliğine santrifüj yapın.
Sonra, uygun kuyuya iki mikrolitre DNA şablonu ekleyin ve kuyuyu sıkıca kapatın. Tüp şeridini tutucudan çıkarın ve tüm reaktiflerin tüpün dibinde biriktiğinden emin olmak için fırlatın. Tüp şeridini LAMP enstrümanına yükleyin ve LAMP koşusunu başlatın.
LAMP reaksiyonu devam ederken, LAMP çalışması sırasında çeşitli parametrelerin dinamik değişimlerini görmek için Sıcaklık, Güçlendirme ve Anneal sekmelerine dokunun.