Canlı Hücre Görüntüleme İçin Myxococcus Xanthus Örneklerinin Hazırlanması

Yavaş büyüyen bir toprak bakterisi olan Myxococcus xanthus kültürünle başlayın.

Koloniyi antibiyotikle takviye edilmiş bir ortama aşılayın.

Hücreler, sadece istenen bakterilerin hayatta kalmasını sağlamak için antibiyotiğe direnç gösterecek şekilde tasarlandı.

Süspansiyonu, ortamı içeren daha büyük bir şişeye aktarın ve optimal büyümeyi sağlamak için sallama ile inkübe yapın.

Görüntüleme sırasında mekanik destek sağlayan metal bir çerçeveye monte edilmiş bir kapak slipi alın.

Bakteri kültürünü üzerine dağıtın, ardından görüntü hizalanması için referans noktası olarak kullanılan floresan mikroküreler ekleyin ve birden fazla görüntü elde edin.

Malzemeyi içeren önceden ısıtılmış bir agaroz pedi yerleştirin, ardından hidrasyonu korumak için üzerine bir örtü örtüyün.

Hücrelerin agarose pedine yapışmasını sağlamak için kuluçka yapın.

Pad, hücrelere besin sağlar ve yavaş büyüyen bakteride çoğalma sırasında hücresel süreçlerin uzun vadeli canlı hücre görüntülemesini mümkün kılar.

Başlamak için, tek bir M. xanthus kolonisini 500 mikrolitre %1 CTT ile antibiyotiklerle takviye edilmiş steril bir tüpte yeniden askıya alın ve tüm süspansiyonu beş mililitre %1 CTT içeren 50 mililitrelik Erlenmeyer şişesine aktarın. %0,2 CTT içeren %1 agaroz mikroskopisi çözeltisi hazırlamak için bir gram agaroz 80 mililitre TPM tamponu ve 20 mililitre %1 CTT ortamı karıştırın. Çözeltiyi agaroz eriyene kadar mikrodalgada ısıtın.

Bir Petri kabını yaklaşık 60 mililitre erimiş agarozla doldurun ve oda sıcaklığına soğutun. Agarose pedini kullanmadan önce en az 15 dakika 32 derece Celsius'ta ısıtın. Sonra, ortasında delik olan plastik veya metal bir çerçeveye steril cam kaplama yerleştirin. Sonra kapak kaymasını çerçeveye sabitlemek için bant kullanın.

Örtü sayfasına 10 ila 20 mikrolitre üstel olarak yetiştirilen M. xanthus hücresi ekleyin. Floresan mikroküreleri hücrelerin fiducial belirteçleri olarak eklemek için, TPM tamponu kullanılarak mikroküreleri 1:100'e kadar seyreltirin. Boncuk süspansiyonunu iyice sallayın ve hücrelere beş ila on mikrolitre ekleyin.

Büyük, önceden ısıtılmış %1 agaroz pedinden, örtü kapak kılıfı büyüklüğünde küçük bir ped kesin ve hücrelerin üzerine yerleştirin. Sonra buharlaşmayı önlemek ve hücreleri nemli ortamda tutmak için pedin üstüne bir kapak koyun. Mikroskopi örneğini 32 derece Celsius'ta 15 ila 20 dakika kuluçka edin, böylece hücreler agaroz pedinin altına tutunabilir ve ardından zaman geçişli mikroskopi kayıtları yapılır.