Değişken Sayıda Tandem Tekrarı (VNTR) Analiziyle Balık Patojenlerinin Tespiti

Formamid bazlı denatürleyici bir çözelti içeren bir PCR plaka ile başlayın.

Her kuyuya balık-patojenik bakteriden elde edilen seyreltilmiş PCR amplikonları ekleyin.

Bu amplikonlar, bakteri tanımlama için genetik belirteç olarak kullanılan kısa tekrarlı diziler olan floresan etiketli değişken sayı tandem tekrarları (VNTR'ler) içerir.

Hava kabarcıklarını yok etmek için plaka ve santrifüjü sızdırın.

Plakayı termal döngücü ile ısıtarak çift zincirli VNTR'leri denatüre edin.

Formamid iplik ayrımını artırır ve yeniden tavlanmayı engeller.

Tek zincirli DNA'yı stabilize etmek için plakayı hızla soğutun.

Örnek hacmini toplamak için santrifüj.

Mühürünü çıkarın ve plakayı bir çerçeveyle sabitleyin.

Kapiller tüpü yerleştirin ve kapiller elektroforezi yapın.

Elektroforez sırasında, VNTR parçaları elektrik alanı altında kapiler içinden geçer ve boyutlarına göre ayrılır.

Bir lazer, her parçadaki floresan etiketleri uyararak renk kodlu sinyaller üretir.

Ortaya çıkan elektroferogram, patojenik bakteriye karşılık gelen VNTR zirve desenlerini gösterir.

PCR amplikonları doğrulandıktan sonra, PCR ürünleri 1'den 10'a kadar arıtılmış suda seyreltmek için yeni PCR şeritleri veya plakaları kullanın. Kısa bir süreliğine vortex ve santrifüj. Duman dolabında çalışırken, formamid ve referans boyutunda standart çözelti içeren bir santrifüj tüpünde master karışım hazırlayın.

Analiz edilecek PCR ürün sayısına göre, manuskriptte detaylandırılan reaktiv hacimleri kullanılır. %10 fazla hacme izin verin. Vortex, mevcut kapiler elektroforez sistemine uygun bir PCR plakasında 9,5 mikrolitreyi kısa süreliğine ve bireysel kuyulara dağıtır.

Sonra, 0,5 mikrolitre seyreltilmiş PCR ürünü ekleyin. Kısa süreliğine sızdırma ve santrifüj yapın. Sonra, örnekleri içeren plakayı PCR termosiklere yükleyin ve örnekleri üç dakika boyunca 95 derece Celsius'ta denatüre edin, ardından süresiz olarak 4 derece Celsius'a soğutur.

1000 g seviyesinde bir dakika boyunca santrifüj yapın, mühürünü dikkatlice çıkarın ve plakayı üreticinin talimatlarına göre kalibre edilmiş bir kapiller elektroforez sistemine yükleyin. Parça analizi kapiler elektroforezini çalıştırın, tercih edilen cihaz için uygun reaktifler kullanılarak ve çalışma koşullarını el yazmasındaki açıklamaya göre ayarlayın.