Patojenik Bakterilerle Enfekte Bitki Yaprak Dokusundan Genomik DNA Çıkarılması

Candidatus liberibacter ile enfekte olmuş bir yaprak alın, bu patojenik bir bakteri.

Parçalara ayırın, sıvı azotta ani dondurun ve bitki hücrelerini parçalayıp içindekilerini, hatta bakterileri serbest bırakın.

Bir çekirdek lizis tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.

Zarları lizlemek için yüksek sıcaklıkta kuluçka yapın, bitki çekirdeklerinden ve bakteri hücrelerinden genomik DNA salın.

RNase enzimi ekleyin, tüpü ters çevirip karıştırın ve inkübe ile parçalanarak RNA'yı bozun.

Protein çökeltme çözeltisi ekleyin ve protein agregasyonunu teşvik etmek için karıştırın. Santrifüjden pellet protein ve hücresel kalıntılara dönüştürülür.

Üst katmanı izopropanol içeren bir tüpe aktarın ve DNA'yı görünür zincirlere çökeltmek için karıştırın. DNA'yı pelletlemek için santrifüj.

Pelleti etanol ile yıkayarak safsızlıkları temizleyin, hava kurutma ve DNA'yı yeniden nemlendirin.

DNA'yı çözündürmek için yüksek sıcaklıkta kuluçka yapın, ardından bir örneği mikroküvete yükleyin.

Bir spektrofotometre kullanarak, izole DNA konsantrasyonunu ölçün.

İlk olarak, temiz makasla bir narenciye ağacından taze bir yaprak kesin ve temiz plastik bir sandviç poşetine koyun. Sonra, az miktarda sıvı azot ekleyerek bir harç ve havanı soğutun. Sonra, makasla yaprak dokusunun yaklaşık bir inç kare boyutunda küçük parçalarını kesin.

Yaprak parçalarını hemen dondurmak için harca koyun. Yaprak dokusunu harç ile hızla öğütmeye başlayın, sıvı azot buharlaşana kadar ve kalan ince yeşil toz kalır. Sonra, metal spatula'yı sıvı azotta 10-15 saniye soğutun. Sonra soğuk spatula ile 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpünde harçtan topraklanmış dokuyu alabilirsiniz.

Numuneye 600 mikrolitre çekirdek liz çözeltisi eklemek için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Sonra, örneği bir ila üç saniye girdabla çevirin. Tüpü 65 derece Celsius'ta, su banyosunda 15 dakika kuluçka yapın.

Kuluçka dönemi bittikten sonra, 10 mikrolitrelik bir pipet kullanarak lizata 3 mikrolitre RNase çözeltisi ekleyerek RNA'yı çıkarabilirsiniz. Sonra, tüpün içeriğini iki ila beş kez ters çevirerek karıştırın.

37 derece Celsius'ta 15 dakika boyunca bir dolap kuluçka makinesinde kuluçka yapın. 15 dakika sonra, numuneye 200 mikrolitre protein çökeltme çözeltisi ekleyin. Tüpü 20 saniye boyunca yüksek hızda girdabla tutun. Sonra, örneği 13000 g ile üç dakika boyunca santrifüj yapın.

Santrifüj sürecinde, oda sıcaklığında tutulan 600 mikrolitre izopropanol yeni 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne eklenin. Santrifüj işlemi bittikten sonra, süpernatantı dikkatlice santrifüj tüpünden izopropanol içeren tüpe çıkarın. Pelleti at.

DNA'nın görünür olmasını sağlamak için tüpü ters çevirin, iplik benzeri bir iplik gibi. Sonra, numuneyi oda sıcaklığında bir dakika boyunca 13000 g santrifüjle yapın.

Santrifüjlemeden sonra süpernatantı dekant edin. Sonra, pellete %70 etanol içeren 600 mikrolitre ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirerek peleti yıkayın.

Tüpü 13000 g ile bir dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işlemi bittikten sonra, süpernatantı dikkatlice aspire edin. Sonra kapak açık halde tüpü emici bir kağıt üzerinde ters çevirip 15 dakika hava kurutmaya devam edin.

Kuruduktan sonra, pellete 100 mikrolitre DNA rehidrasyon çözeltisi ekleyin. DNA süspansiyonunu 65 derece Celsius sıcaklığında bir saat boyunca su banyosunda kuluçka edin. Karıştırırken tüpü periyodik olarak dokun.

Mikro-küvette 1 mikrolitre arıtılmış su ekleyin. Spektrofotometrede suyu boş olarak oku. Sonra, mikroküvete 1 mikrolitre numune ekleyin. Mikroküveti spektrofotometreye yerleştirin ve DNA konsantrasyonunu alın.