İndüklenebilir bir gen ifade sisteminin bakteriyel efektör proteini ifade eden hücrelere aktarılması

İnsan hücrelerinin CaeB'yi eksprese eden test yapın; bu anti-apoptotik bir bakteriyel proteindir.

CaeB'nin olmaması gereken hücreleri kontrol olarak kullanın.

Hem regülatör hem de yanıt plazmidleri içeren tetrasiklin-indüklenebilir gen ifade sistemiyle kompleksleştirilmiş bir transfeksiyon reaktifini tanıtın.

Regülatör plazmid bir transkripsiyonel aktivatör ve susturucu kodlarken, yanıt plazmidi TRE tarafından kontrol edilen pro-apoptotik bir proteini kodlar.

Hücreleri inkübe ederek plazmid alımını ve düzenleyici protein ekspresyonunu kolaylaştırın.

Tetrasiklin olmadan aktivatör passif kalır ve susturucu TRE kaynaklı transkripsiyonu bastırır.

Bir tetrasiklin analogu ekleyin ve kuluçka yapın.

Analog, aktivatör–TRE bağlanmasını sağlar ve pro-apoptotik protein ekspresyonunu başlatır.

Kontrol hücrelerinde bu, apoptotik sinyalasyonu tetikleyerek apoptotik bir belirteç aktive eder.

CaeB-eksprese eden hücrelerde CaeB, apoptotik sinyalasyonu inhibe eder ve belirteç aktivasyonunu azaltır.

CaeB-eksprese eden hücrelerde azalmış belirteç aktivasyonu, CaeB'nin apoptozu inhibe ettiğini gösterir.

Bu işleme, 12 kuyu başına 100.000 hücre yoğunluğunda GFP veya GFP-CaeB'yi stabil şekilde ifade eden HEK293 hücre