JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:35 dk. • November 28th, 2025
Bakteriyi hareketsiz hale getirmek ve tek tabakalı büyümeyi desteklemek için agaroz jel pedinin altına gömülü bakteri içeren bir kültür plakası ile başlayın.
Bakteriler, genetik olarak yeşil floresan proteini ifade eder ve gen ifadesinin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar.
Numuneyi kapamak için padin etrafına ek agaroz jeli dökün ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.
Plakayı bantla mühürleyin, gaz değişimi için delin, kondensasyonu önlemek için ters çevirin.
Jelin stabilizasyonu ve bakteri bölünmesini önlemek için plakayı düşük sıcaklıkta kuluçka edin.
Sonra, objektîfe daldırma yağı uygulayın ve plakayı konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin.
Zaman geçişli görüntülemeyi başlatın.
GFP yavaş yavaş olgunlaştıkça, floresan işlemeye başlar. Hücre bölünmesi sırasında, bu floresan proteinler kız hücreler arasında dağılır ve floresan yoğunluğunda düşüşe neden olur.
Bu, testere dişli bir floresans deseni oluşturur ve aynı ortamdaki genetik olarak özdeş hücreler arasındaki bu desendeki farklılıklar, gen ifadesinde biyolojik gürültü gösterir.
Örnekleri görüntülemek için maseleri sudan çıkarın ve jel çözeltinin vücut sıcaklığına kadar soğumasına izin verin. Örnek plakasının çevresine üç milimetre jel dök. Agaroz katılaştığında, plakayı bantla mühürleyin ve 25 gauge iğneyle banda birkaç delik delin.
Sonra plakayı dört derece Celsius'ta en az 30 dakika ters koyun, böylece agaroz tamamen katılaşabilir ve hücre mitozunu önler. 24 saat içinde, örneği en düşük büyütmede bulmak için floresans konfokal mikroskobu kullanın ve mikroskobun otomatik odak sistemini devreye alın. Uygun hedefe yağ uygulayın ve platform kontrolörüyle plakayı hareket ettirerek yağı dikkatlice yayabilirsiniz.
Sonra otomatik odaklama tekrar açın ve örnekle ilgili varsayılan Z adım kesitleri önerisini takip edin.