JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:23 dk. • November 28th, 2025
Staphylococcus aureus'un silika boncukları içeren bir soğutma çözeltisinde askıya getirilmesiyle başlayın; metabolik durumunu korumak için düşük sıcaklıkta saklanır.
Bakterileri soğuk koşullarda homojenize ederek hücre içi içeriği serbest bırakarak metabolitlerin enzimatik bozulmasını en aza indirin.
Lizat santrifüj edilip metabolit açısından zengin süpernatantı elde edin.
Öze organik bir çözücü ekleyin ve çözünür metabolitlerden makromoleküller çökeltmek için vortekse bağlanın.
Santrifüjle çökeltiyi pellet eterek üst sıvıyı şişelere aktarın.
Şişeleri sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi sistemine yükleyin.
Kromatografi kolonunun içinde, metabolitler kimyasal özelliklerine göre katı durağan fazlayla etkileşime girer.
Metabolitleri elütasyon etmek için bir tampon ekleyin. Sonra, metabolitleri kütle spektrometresinin elektrosprey iyonizasyon kaynağına yönlendirerek iyonlaştırın.
İyonlar daha sonra kütle-yük oranlarına göre ayrılır.
Ortaya çıkan veriler, metabolitleri tanımlamak için referans veritabanı ile karşılaştırılır.
Metabolit çıkarımı başlatmak için önce örnekleri ıslak buz üzerinde eritirin. Sonra hücreleri bir homojenizerde 6000 rpm'de dört adet 30 saniyelik patlama ile bozun, döngüler arasında kuru buzda iki dakikalık soğutma dönemi var.
Lizatları maksimum hızda önceden soğutulmuş bir mikrosantrifüj tüpünde 15 dakika boyunca temizleyin. Santrifüjlemenin ardından, süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bir mikropipet kullanarak, metin protokolünde tanımlandığı gibi kalıntı peptid içeriğinin nicelendirilmesi için küçük bir parça mikrosantrifüj tüpüne aktarılır.
Kalan numuneyi eksi 80 derece Celsius'ta sakla. Metabolitlerin sıvı kromatografisi ve kütle spektrometrisi yoluyla analizi için metin protokolüne başvurun.