Koklear İç Saç Hücreleri Ulaşın Afferent Dendritler postsinaptik Kayıtlar: Şerit Synapse Multivesicular Yayın İzleme

Bu prosedürün genel amacı, iç kıl hücresi afferent sinapslarında sinaptik sonrası aktiviteyi kaydetmektir. Bu, ilk olarak, kafası kesilmiş bir sıçandan yakın zamanda çıkarılan bir kokleanın duyusal epitelini açığa çıkararak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, eksize edilen apikali pozisyona yerleştirmek, modifiye edilmiş bir kapak fişini açmak ve kayıt odasına aktarmaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, bir kayıt elektrodu ile afferent bir batonu bulmak ve ona erişim sağlamaktır. Prosedürün son adımı, yama kelepçesi tekniğinin tüm hücre konfigürasyonunu oluşturan afferent fiber zarı üzerine sıkı bir sızdırmazlık oluşturmak ve ardından yırtmaktır. Sonuç olarak, tüm hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi yoluyla tek bir şerit sinapstan post-sinaptik oluşumu veya potansiyelleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Koklear dokunun diseksiyonu ve hazırlanmasının öğrenilmesi zor olması ve küçük afferent liflerin tanınması ve erişilmesi zor olması nedeniyle bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Diseksiyona başlamadan önce, kayıtlar sırasında hazırlığı yerinde tutacak modifiye edilmiş bir kapak fişi hazırlayın. Sekiz ila 12 milimetrelik dairesel bir cam kapak fişi kullanarak, kapak fişinin kenarına doğru bir damla yarı kürlenmiş syl koruyucu uygulayın.

İnce bir böcek iğnesinin kalın ucunu kapak fişinin üzerine yerleştirin. Böcek pimini cama sıkıca tutun. Forseps ile eşik korumasını ayarlamak için ısıtılmış bir bobine karşı ısıtın.

Ekteki metinde açıklandığı gibi 10 ila 20 mikro elektrot hazırlayın. Bir mikro dövme ile yangın parlatma işleminden sonra, mikro elektrotun yaklaşık bir mikronluk bir dış uç çapına sahip olması gerekir. Pipet duvarının son kalınlığı, üç haftalık bir sıçanın anestezi ve dekapitasyonunu takiben bir mikrometrenin yaklaşık üçte birine eşittir.

Kafayı diseksiyon yaparak ve beyni çıkararak cildi çıkararak diseksiyona başlayın Temporal kemiği ortaya çıkarmak için her iki temporal kemiği de çıkarın. Her temporal kemiği standart hücre dışı çözelti içeren temiz bir diseksiyon kabına yerleştirin. Bir sonraki adım, kokleayı açığa çıkarmak için temporal kemiği kapsülleyen kemiği çıkarmaktır.

Temporal kemiği bir çift forseps ile tabanda güvenli bir şekilde tutun. Yuvarlak ve oval pencereyi ve kokleayı tanımlayın. Kokleayı, oval pencere ve kokleanın spiral tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin.

Koklea etrafındaki fazla kemiği çıkarın. Kemiğin geri kalanından daha şeffaf olan alandan başlayarak kemiği doğrudan kokleadan ayırmak için ikinci bir çift ince forseps kullanın. Burada kemik daha incedir ve çıkarılması daha kolaydır.

Apikal bobinin etrafındaki kemiği çıkarmaya devam edin. Apikal dönüşün altındaki modileri kesmek için mikro diseksiyon makası kullanın. Ardından apikal dönüşü kokleanın alt dönüşlerinden ayırın.

Apikal bobini korumaya özen gösterin. Çekilmemeli veya gerilmemelidir. Son olarak, dokuyu çok fazla yırtmadan apikal dönüşü kokleadan çıkarın.

Kemiğin geri kalanını çıkarmak için ince forseps kullanın. Bir sonraki adım, okülisin STR'sini ve tial membranı çıkarmaktır. Saç hücresi bölgesinin dışında yer alan parlak doku şeridi olan oculis'in STR'sini dikkatlice çıkarın.

Okülis STR'si ile birlikte kolayca ayrılabilen duyusal saç hücrelerini çıkarmaktan kaçındığınızdan emin olun. Ardından, tial membranı ayırmak için ince forseps kullanın. Duyusal saç hücrelerinin üzerinde yer alan parlak yarı saydam zar artık fazla doku ve kemiği kesiyor ve prepareti forseps ile düzleştiriyor.

Bu, dokunun bir pimin altına eşit şekilde yerleştirilebilmesi için gereklidir. Diseksiyon artık tamamlanmıştır. Preparatı, diseksiyon tamamlandıktan sonra pimi saç hücrelerinden uzağa yerleştirmeye dikkat ederek, hazırlanan lamel üzerindeki pimin altına yerleştirin.

Preparatı kayıt odasına aktarmak için forseps kullanın, koklear dokuyu tutan kapak kızağı üzerinde bir damla hücre dışı sıvı tutarken, hemen hücre dışı solüsyonla bolluğa başlayın. Preparatın daha iyi hayatta kalmasını sağlamak için mikroskobun 10 x objektifini veya 40 x suya daldırma DIC objektifini kullanın. Preparatörü bulmak için, preparatı, kayıt elektrotları iç saç hücrelerine yan duvarlarına dik açıyla yaklaşabilecek şekilde yönlendirin.

Preparat kıvrıldığı için iç saç hücrelerinin bazal bölgesinin görünürlüğü sınırlıysa, preparatın dış kenarını cam kapak kızağına doğru itmek için bir kayıt elektrodu kullanın. İç saç hücrelerinin kendilerine bastırmamaya özen gösterin. Bu hazırlıkta, üst elektrot, preparatın dış kenarını, afferent batonların bulunduğu alt elektrot işaretlerinden aşağı doğru tutar.

Referans olarak, NC 70 Nuv Con kamera, iç saç hücresi bölgesindeki dokunun sağlıklı olup olmadığını değerlendirmek için monitörde Forex büyütülmüş görüntüyü görüntüler. Referans noktası olarak saç demetlerini bulun ve çekirdekleri bulmak için aşağıya odaklanın. Afferent uçları olan iç saç hücrelerinin tabanına doğru daha aşağıya odaklanın ve monitördeki çekirdek seviyesine ulaşana kadar geri dönün.

Şimdi iç saç hücrelerinin tabanının etrafındaki afferent copları bulun. Batonlar küresel veya elipsoidaldir, yaklaşık bir mikron çapındadır ve parlak bir görünüme sahip açık renklidir. Onları yukarı ve aşağı odaklanarak bulacaksınız.

Bir sonraki adım, hücre içi çözelti ile doldurulmuş bir mikron uçlu bir kayıt elektrodu kullanarak afferent liflere giden bir yolu temizlemektir. Pozitif basınç uygulayın ve elektrodu preparasyona yönlendirmek için mikro manipülatörü kullanın. Preparatta iç saç hücresi tabanı seviyesinde bir kesi yapmak için bu elektrotu kullanın.

İç saç hücrelerinin tabanındaki alana bir erişim yolu oluşturmak için pozitif basınç kullanarak elektrotu ince destekleyici hücre tabakası ile iç saç hücreleri arasına itin. Elektrodu dikkatlice çıkarın ve hücre içi çözelti ile doldurulmuş bir mikron çapında ucu olan yeni bir elektrotla değiştirin. Temiz bir elektrot ucunu korumak için pozitif basınç kullanarak, kayıt elektrodunu bitişik destek hücrelerinin etrafındaki erişim deliğinden afferent batona doğru hareket ettirin.

Elektrot ucunun doğrudan afferent batonun önünde olduğundan emin olun, pipetin hareketine karşı destekleyici hücrelerden ve iç tüy hücresi zarından daha fazla direnç sunar. Pipet hareket ettirildiğinde bu fark hissedilebilir, pipeti yukarı ve aşağı hareket ettirin ve bhuton'un hareket ettiğinden emin olmak için itin. Bu, pipet ucunun ve bhuton'un, afferent bhuton'a bastırılan elektrot ile aynı odak düzleminde olduğunu gösterir: Aynı anda pozitif basıncı serbest bırakın ve bir giga ohm conta oluşturmak için emme uygulayın.

Bütün bir hücre kaydı elde etmek için elektrot içindeki zarı yırtmak için hafif emme patlamaları uygulayın. Yamalı hücre afferent bir baton ise, tüm hücre kayıt modunda küçük kapasitif geçişler gözlenir. Bu şekil, afferent bir elyaftan kaydedilen tipik geçici durumu göstermektedir.

Sinaptik aktiviteyi kaydetmeye başlayın. Afferent lif spontan aktivite göstermezse, daha yüksek potasyum konsantrasyonuna sahip hücre dışı bir çözelti uygulayarak saç hücresini depolarize edin. Bu şekil, soldaki AFF lifleri ve sağdaki iç saç hücreleri için tipik akım voltajı ilişkilerini göstermektedir.

Akım voltaj ilişkileri, 10 milivoltluk artışlarla eksi 124 milivolttan pozitif 36 milivolta kadar voltaj adımlarıyla eksi 84 milivoltluk bir tutma potansiyeli kaydedildi. Gerilimler, afferent bir fiberden gelen akım voltajı ilişkilerine odaklanan bazı izlerin sağında gösterilmiştir. Uyarıcı post-sinaptik oluşumun veya EPC'lerin voltaj adımlarının çoğunda mevcut olduğunu unutmayın.

EPC'ler, yaklaşık pozitif altı milivoltta pozitifi tersine çevirdi. Bu kayıt, bloker olmadan voltaj kapılı sodyum akımlarını bloke etmek için tetra ila toksin varlığında gerçekleştirildi Hızlı aktive olan sodyum içe doğru akımlar ayrıca kayıtta görünecek ve kaydı afferent bir fiber kaydı olarak tanımlayacaktı. Hiperpolarize voltajlarda yavaşça aktive olan içe doğru akıma dikkat edin.

Bu akım, iç tüy hücrelerinde veya destekleyici hücrelerde bulunmaz ve kaydın afferent bir elyaftan geldiğine dair iyi bir gösterge sağlar. Bu kayıtlar, bir iç tüy hücresi için akım voltajı ilişkilerini gösterir. Ok, pozitif potansiyellerde hızlı aktive olan dışa doğru potasyum akımlarına işaret eder.

Bunları, dar pipet çapı ve yüksek erişim direnci nedeniyle gecikmeli doğrultucu potasyum akımları takip eder. Burada gösterilen iç tüy hücresi akımları, iç tüy hücresi akımlarının doğru kayıtlarını elde etmek için beklenenden daha küçüktür. Daha düşük erişim direncine sahip pipetler kullanılmalıdır.

Bununla birlikte, burada sunulan kayıtlar, iç tüy hücrelerinin ve afferent liflerin akım voltaj ilişkilerinin açıkça ayırt edilebileceğini göstermektedir. Bu şekil, afferent bir elyaftan kaydedilen sinaptik akımları göstermektedir. EPC'lerin değişken boyutuna ve şekline dikkat edin.

Kayıtlar, voltaj kapılı sodyum akımlarını bloke etmek için tetra toin uygulanarak oda sıcaklığında yapıldı. Bu şekil, bir iç saç hücresinden ve temas eden bir afferent batondan eşzamanlı kayıtları göstermektedir. İç saç hücresini depolarize etmek için bir voltaj aşaması kullanıldı ve buna yanıt olarak, iç tüy hücresi kalsiyum akışından içe doğru kalsiyum akımları kaydedildi, bu da nörotransmitter salınımı ve afferent batonda aktive edilmiş EPC'ler ile sonuçlandı.

Bu prosedürü denerken 50 milisaniyelik bir iç kıl hücresi depolarizasyonu sırasında ortaya çıkan sinaptik depresyona dikkat edin. Koklear dokuyu parçalara ayırmaya ve hazırlamaya özen göstermeyi unutmamak ve afferent terminallerden kayıt yapmaya çalışırken sabırlı ve iyimser kalmak önemlidir.